非嚙齒類動物在生殖毒性試驗中的應用進展

張元慧，蔣建東，孔維佳*

(1.中國醫學科學院北京協和醫學院醫藥生物技術研究所，北京 100050；2.中國醫學科學院北京協和醫學院藥物研究所，北京 100050)

隨著醫療水平的提高，新生兒畸形現象正在逐漸減少，然而不孕不育癥卻愈發嚴重，據最新文獻報道，全球范圍內大概有20%的人患有不孕不育癥[1]，這引起了人們對生殖毒性研究的重視。生殖毒性是指外源因素(如藥品、食品添加劑、環境污染物、輻射)對親代生殖功能和子代生長發育所產生的有害作用[2]，該研究是安全性評價的重要內容。在進行生殖毒性試驗時，實驗動物的選擇對于研究具有重要意義，一般會采用兩類動物進行實驗，即嚙齒類動物和非嚙齒類動物。非嚙齒類動物通常會選擇家兔，在一些特殊條件下也會選擇其他動物進行實驗，如犬、小型豬或非人靈長類動物。生殖毒性研究主要根據受試物的藥代動力學特點、藥理學和毒理學信息進行判斷，通常選擇對受試物的體內代謝過程以及毒效學參數與人體相似的實驗動物[3]。目前，對于非嚙齒類動物在生殖毒性研究中的應用資料較少。因此，本文根據不同實驗動物的自身特點，對各種非嚙齒類實驗動物模型在生殖毒性研究中的現狀進行總結，旨在為科研工作者選擇合適的動物模型提供一些參考。

1 家兔

家兔作為生殖毒性研究的動物模型具有很多優點：無發情期，一年四季均可交配繁殖；妊娠期較短，一般為30～33 d；繁殖能力強，每胎產仔數7～12只[4]。家兔屬于刺激性排卵動物，經過交配的刺激后可進行排卵。其胎盤是血竇內皮型，與人類的血竇絨毛型胎盤較為相似。生殖道與人類最接近，適用于評價避孕藥和局部用的藥物(如凝膠劑、陰道環等)[5]。

在對新型左炔諾孕酮和炔雌醇復方避孕貼劑進行安全性評價時，研究人員選用了新西蘭家兔進行實驗，多次給予此避孕帖后家兔的體內并未發生藥物蓄積[6]。Susheela等人[7]在研究飲用水中超標氟化物對生殖功能的影響時，發現氟化處理可導致家兔精小管退化、抑制精子生成，這與氟化物對人體產生的影響一致。另有研究發現，在停藥期間給予家兔維生素D和E可以修復氟化物引起的生殖功能損傷[8]，這為超標氟化物引起的不孕不育癥提供了新的治療手段。

家兔由于具有上述優點，在生殖毒性試驗中應用最多，積累了豐富的基礎數據。但家兔是食草動物，對能夠引起消化道功能紊亂的化學物質以及抗生素類藥物較敏感，臨床表現難以解釋，因此不適合評價此類物質。

2 犬

犬無需借助電刺激等痛苦的采精技術即可獲得精子，因此常用于精子數量、成熟度和活力測定的分析研究[9]。目前國際公認的標準實驗用犬為比格犬，其具有體型小，性情溫順，便于實驗操作的優點[10]。同時，其生理生化指標穩定，實驗結果的重復性好，遺傳學資料豐富[11]。另外，比格犬易于馴化，能夠采用注射等在其他實驗動物不宜操作的給藥方式[12]。

羥胺基組蛋白去乙酰化酶抑制劑HZ1006是一種有臨床應用前景的抗癌藥物，研究者選擇了比格犬作為該藥物臨床前毒性評價的動物模型，實驗表明男性生殖道、消化道、呼吸道和血液系統可能是HZ1006的毒性靶點，提示該藥物可能存在一定的生殖毒性[13]。另有研究者發現犬對谷物中廣泛存在的玉米赤霉烯酮的毒性作用敏感，幼齡雌犬接觸低劑量玉米赤霉烯酮可引起子宮和卵巢功能異常，類固醇激素發生變化，生育能力下降[14]。

但是，犬是季節性繁殖動物，只在春秋季發情，產仔數量變動較大，每胎2～10只不等，并且存在近親繁殖因素的影響，這些特點均限制了犬在生殖毒性試驗中的應用。已有文獻表明犬對抗高血壓藥物、擬交感神經藥物和非甾體抗炎藥物的反應與人體存在較大差異[15]，因此不適用于此類藥物的安全性評價。

3 小型豬

小型豬在生理學和解剖學等方面與人類有很多相似性，具有胎仔數量多、性成熟時間短等優點。動情周期、子宮組織學和精子學資料與人類非常接近[16]。有證據表明[17]，小型豬對很多人類致畸物質敏感，如乙醇、羥基脲、維甲酸、沙利度胺、氨基蝶呤等。相對于其他實驗動物，小型豬對這些化合物的反應性可能更具有參考價值。

在進行維甲酸的致畸作用研究時，研究人員選用了哥廷根小型豬進行實驗，證實了維甲酸的致畸作用非常明顯[18]，該研究結果顯示，隨著給藥劑量的增加，胎仔畸形發生率不斷上升，畸形程度也越來越嚴重，且畸形表現與人類的視黃酸胚病(小頜、小耳、腭裂、心臟和胸腺的缺陷、中樞神經系統異常)極為相似。另外，Hayama等[19]發現在器官形成期給予孕豬乙嘧啶可導致上腭裂等結構性缺陷，也可引起后肢癱瘓等功能性缺陷。美國食品藥品監督管理局在2013年批準上市的新藥阿法替尼[15](主要用于治療晚期非小細胞肺癌和晚期乳腺癌)，在其臨床前安全性評價中，由于犬發生嚴重的胃腸道反應，研究人員選用了哥廷根小型豬進行安全性評價，表明小型豬在新藥臨床前研究中具有良好的應用前景[20]。

目前，小型豬在生殖毒性評價方面的應用還存在一些局限性。首先，小型豬的體型較大，導致實驗人員的操作難度增加，操作過程中體能消耗較大。其次，目前尚無用于研究的商業試劑盒[21]，給實驗帶來一定困難。最后，小型豬的胎盤不能轉移大分子物質，無法用于抗體、疫苗等生物制品的安全性評價。

4 非人靈長類動物

非人靈長類動物與人類的生殖系統具有很多相似性，首先兩者均是單胎妊娠，內分泌系統對生殖功能的調控都是通過下丘腦-垂體-卵巢軸進行[22]，均在更年期階段喪失生育能力。女性的生理周期一般是30 d左右，而雌猴一般是28 d[23]。雌猴生殖道的生理結構，包括輸卵管、子宮和陰道均與人類具有可比性。胎盤的生理結構和轉移機制等方面也與人類相似[24-25]。

非人靈長類動物在比較胎兒和新生兒發育能力方面具有極大優勢，特別是腦部發育。與大腦發育不成熟的嚙齒類動物不同，新生恒河猴在出生時腦白質明顯增多，這使得恒河猴成為評估不良妊娠(如胎盤功能不全、胎兒生長受限和子癇前期)導致新生兒認知和行為異常的良好模型[26-27]。

Frias等人[28]通過研究發現，雌性恒河猴長期接觸尼古丁(接近懷孕女性吸煙者的水平)后，胎盤血流量在短期內降低，絨毛組織學異常。然而，聯合服用抗壞血酸藥物(如維生素C)減輕了這些變化。這些研究表明產前接觸尼古丁對胎盤結構和功能產生有害作用，并為補充維生素C可以減弱孕期吸煙的一些不良影響這一發現提供了新的證據。

雖然非人靈長類動物生殖系統的結構和功能與人類最為相近，在生殖毒性研究中具有極大的應用價值，但其價格昂貴，資源稀缺，對于實驗方案設計和執行均有一定挑戰。另外，非人靈長類動物面對極大的動物福利壓力和倫理挑戰，進一步限制了其在此類研究中的應用。

5 斑馬魚

斑馬魚的基因組與人類的基因相似度高達87%[29]，這使其成為人類疾病研究的良好動物模型。在生殖毒性試驗中，斑馬魚具有其他動物無法比擬的優點：生殖周期短，每次產卵數量多，胎仔發育迅速。個體小，對環境適應力強，可以減少實驗周期和成本。在早期發育階段通體透明，便于開展胚胎、胎仔的發育研究[30-31]。另外，斑馬魚和人類的生殖調控系統具有高度相似性，這使得研究人員能夠通過研究斑馬魚的重要神經元，以及生殖激素及其作用效果來全面地研究和理解人類生殖系統[32-33]。

隨著研究的不斷深入，斑馬魚逐漸成為科學家們評估人類生殖系統潛在危險化合物的良好動物模型，特別是評估環境污染物。以哺乳動物為主的評估生殖毒性的分析方法耗時、復雜且昂貴，需要進行大規模的實驗分析[34]。同時，哺乳動物往往需要較高劑量，但環境中化學物質的濃度水平往往較低[35]，從而導致現實環境的毒性水平無法預測。而微量的化合物在較短的時間內就可以進入斑馬魚體內，因此斑馬魚可以作為環境污染物研究的最佳實驗動物模型。此外，斑馬魚易受基因操縱，為研究基因對繁殖的影響提供了一個新的選擇[36]。

Webster等人[37]將斑馬魚暴露于除草劑草甘膦后，發現斑馬魚cyp19a1基因的表達上調、芳香化酶的活性以及卵巢中主要雌激素受體esr1的表達均顯著增加，從而揭示草甘膦對斑馬魚生殖器官的類固醇合成具有破壞作用。Lopes等人[38]在暴露于草甘膦的成年雄性斑馬魚中也觀察到抗氧化基因的上調和精子運動性降低的現象，這表明草甘膦在誘導睪丸氧化應激方面具有一定作用。這與許多人類細胞體外研究結果一致[39]，均揭示了草甘膦通過破壞激素合成、抑制芳香化酶活性而使精子和卵子質量下降，最終導致胚胎早期發育階段死亡率上升。

迄今為止，斑馬魚作為生殖領域的研究模型只有十幾年[40]，與其他傳統的高等脊椎動物相比，其生殖系統的基礎資料明顯缺乏，特別是對雄性生殖系統的了解還很有限。另外，斑馬魚是卵生動物，交配方式是體外受精，這與人類的繁殖方式存在巨大差異。

6 小結

綜上所述，在評價避孕藥、凝膠劑和陰道環等局部給藥的藥物時可以優先考慮家兔作為研究對象。評價孕激素類和生育調節藥物時，非人靈長類動物是最好的選擇。斑馬魚適用于評價環境污染物和作用于中樞神經系統的藥物。犬不適合評價抗高血壓藥、擬交感神經藥和非甾體抗炎藥。小型豬不適合評價抗體、疫苗等大分子藥物。所有動物模型都有其優點和局限性，家兔胎仔數量多、便于操作，但是食草性動物，消化道與人類存在差異。犬生理指標穩定、結果的重復性好，但犬是季節性繁殖，給實驗設計帶來較大困難。小型豬對某些致畸物質的反應與人類存在相似性，但其胎盤無法轉移大分子物質。非人靈長類動物是單子宮、有月經周期，但價格昂貴、資源稀缺、動物福利壓力大。斑馬魚與人類基因高度一致，在發育前期通體透明、便于觀察，但斑馬魚是卵生動物，繁殖方式與人類存在一定差異。因此，在研究人類生殖毒性時，并沒有單一的理想動物模型，應根據受試物的理化性質、與人體的相互作用以及實驗動物的特點進行綜合考量，選擇最適合的動物模型，在一定條件下也可采用多個動物模型進行評價。