兔腦出血模型研究進展

齊俊芳，包 龍

(蘇州大學附屬第一醫院，江蘇 蘇州 215000)

腦出血是指由腦血管破裂引起的腦實質出血。我國腦出血占所有腦卒中的18.8%～47.6%。腦出血發病率危險，病情變化迅速，死亡率高。3個月內的死亡率20%～30%[1]。腦出血造成了沉重的社會經濟負擔，故對腦出血的病因、病理生理改變、診斷、治療等方面的研究近年來重視程度逐漸加深。為了更好的認識和了解腦出血，需借助于與臨床作用機制相似的模型，并通過它來研究其病理生理機制、診斷、治療等。因此，制作穩定且可復制的腦出血動物模型尤為重要。腦出血的動物模型始建立于20世紀60年代，通過輸注自體血建立腦出血模型，主要應用于狗、猴子、貓等大型動物[2]。隨后由于立體定位儀的發明、動物倫理、費用等原因，加之大鼠尾狀核較易定位，更多的重心放在大鼠腦出血模型的一系列研究上，因此腦出血的大鼠模型較為成熟。而兔腦出血模型始于20世紀80年代[2]，與大型動物模型相比費用較少，且其高成功率和低長期死亡率可以幫助醫療人員更好研究腦出血后的長期神經功能和病理生理機制；與大鼠相比，兔基底神經節更發達，兔腦容積明顯大于大鼠，便于外科手術和標本采集。因此，是較為理想的制作腦出血模型的動物。

1 兔腦出血模型的建立方法

1.1 自體血注入腦出血模型

該模型的建立主要分為采血過程和血液注入過程。

取血過程：根據自體血的來源，一般有以下幾種：耳正中動脈血，股動脈血[3-4]，心室血[5-6]。心室穿刺血液采樣血液采集時間短，不易凝固。然而穿刺過程有導致心跳驟停的風險，實驗中應用率不高。股動脈血液采集創傷性大，采血成功率低，影響下肢功能，干擾行為觀察評分[2]，需抽取少量血液時一般不作為首選。耳正中動脈采集血較為簡便，損傷較前兩者都小，不影響動物的行為學評分，但取血時間稍長且易凝血，需采血成功后盡快注入腦內，此為建造兔腦出血模型中最為常用的采血方法。在兔腦出血實驗中為了更好模擬臨床腦出血，大多數實驗動脈血不抗凝，直接將新鮮動脈血注入腦內。

注血過程：獲得自體血后，如何注入腦內又是個很關鍵的問題。自體血注入腦出血模型目前主要有兩種方法：一種是抽取新鮮的自體動脈血，然后直接注射到大腦中，另一種是動脈插管顱內注射。注射目標區域多選擇基底節區(人腦出血好發部位)，另外可根據不同的研究目的、實驗要求選擇不同的注入部位，如基底節區、腦葉等均可。目前，多采用立體定位儀與兔腦圖譜結合使用以進行定位。固定兔頭后，沿正中線作切開口，暴露“十”字縫和“人”字縫。調整兔頭部平面，使“十”字縫比“人”字縫高1.5 mm。參考Sawyer兔腦立體定位圖譜[7]，根據目標區域找到對應坐標。該圖譜將穿過前囟中心(十字縫中心)的冠狀面，作為冠狀零平面(AP0)。A1表示AP0前1 mm的冠狀面，P1表示AP0后1 mm的冠狀面。將通過十字縫交叉點的矢狀平面作為矢狀零平面，如 R6代表矢狀零平面右6 mm的矢狀平面，水平零面 H0在顱骨頂前囟下方12 mm處的水平面。制作兔腦出血模型時常用的位置有：內囊后肢(P1 mm, R6 mm, H13 mm)[8]，基底節外側區(A2 mm, R5 mm, H6 mm)[4]等。注血量多為動物腦體積的1%～5%，兔為0.5～3 mL[9]。1985年Kaufman等[10]首次將兔用于顱內出血(intracerebral hemorrhage，ICH)模型研究，用0.5 mL、0.75 mL、1.5 mL、2.0 mL、3.0 mL等不同注血量將一組兔腦出血的形態學和生存率進行了比較。其中注射2～3 mL血液的兔死亡率為41%，且分組中注射2 mL，2.5 mL，3 mL自體血的兔隨著注入血液的增多，兔的死亡率逐漸增高，分別為1/9，4/6，2/2，這些兔的死亡在注血后幾小時內即可迅速發生。故若需要長期觀察兔模型，為保證兔的長期生存率，在兔腦出血的建造中要控制注血量，該實驗提示控制在1.5 mL以下相對較為安全。另外在該實驗中也觀察到小劑量注血后血液易進入腦室或蛛網膜下腔的情況，超過2 mL時可觀察到明顯的血液溢出，故在制作兔腦出血模型時需考慮到注射壓力高導致破入腦室或沿針道返流的問題，注血量，注射速度，留針時間都是關鍵。而近幾年有學者分梯度定量向兔腦內注血，結果示0.3 mL是最佳注入量[4]，而另外也有學者注入0.5 mL血液兔也耐受良好[11-13]。從近些年文獻來看，注血量無統一定論，綜合來看注血量均不超過0.5 mL、注射速度不超過40 μL/min。

一種是將新鮮的自體動脈血直接注入大腦。具體如下：2001年張亦波等[4]采用雙套管結合微量泵和立體定位術進行兩次注血、三次拔針法成功造出了兔腦基底神經節出血模型。雙套管包括內套管和外套管以及針芯。第一步：以40 μL/min向套管內注入目標注血量的血1/4，然后將針芯插入內套管，停針7 min；第二步：將內插管向下插入2.5 mm(通過血凝塊)并從股動脈抽取0.3～0.5 mL新鮮血液。使用顯微注射泵以40 μL/min將剩余的3/4血液注入套管，再將針芯插入套管內。拔針分三步：第一步：插入芯后，將套管固定8 min后，將內套拉出2.5 mm；第二步：在該位置固定套管10 min后，將兩個套管同時拔出3 mm；第三步：該位置固定12 min后，將兩個套管同時緩慢拔出。本實驗形成的34例腦內血腫均為100%，針道血液返流率為0。作者將新鮮的未肝素化自體血注入34只兔基底神經節的側面區域，并通過連續冰凍切片計算血腫體積、觀察血腫本身和周圍組織形態。結果300 μL組中的20只兔只有2例失敗，合格率達90%，且失敗的兔考慮與針的定位和麻醉的不穩定性有關。500 μL組8只兔的合格率僅為62.5%，3例不合格。因此，筆者認為注射量300 μL所形成的出血量適中，可觀察到兔有腦出血后的癥狀表現，較少出現短期內迅速死亡的事件，故是適當的血液注射量。該實驗中的方法避免了兔注血期間的血液反流，和在拔出針頭時和取出針頭后，由針頭路徑中的血液損失引起的血腫量的差異。而2009年Yu等[3]采用了類似的方法建造兔腦出血模型。據報道該方法的實驗存活率達到了93.5%，且未發生破入側腦室和蛛網膜下腔的意外，該方法使自體血注射法形成腦內血腫模型達到穩定可控。另外在制作腦出血模型時，考慮到兔的凝血時間約為5 min[14]，留針時間一般都不小于5 min[3-4, 6, 12, 15-16]。

另一種是通過動脈插管進行顱內血液注射。2001年Qureshi等[17]為了研究與腦出血相關的細胞損傷，遂利用此法建造兔腦出血模型，通過自制的分流導管將動脈血立體定位植入兔的額葉，并使用兔的動脈壓將血液緩慢注入額葉的深部。該實驗指出緩慢的灌注會限制血液破入蛛網膜下腔或腦室，且可以模擬漸進的腦出血血凝塊形成過程，更接近人類腦出血的自然過程。

自體血注入腦出血模型不能模擬腦出血時動脈破裂和快速血腫形成的過程，也不能模擬出血后血腫的持續擴張。然而，由于注射的為非肝素化的自體血，故可以觀察到血液凝固過程中血管活性釋放物質對腦循環和腦組織的影響。因此，它更接近臨床腦出血，并且在一定程度上類似于人腦出血的病理過程，加之操作簡單且易于定位，可根據實驗目的選擇目標區域致大腦各個部位出血，故在家兔腦出血模型制作時是最常用的方法。

1.2 膠原酶誘導腦出血模型

膠原酶是一種金屬酶，可以破壞細胞基底膜和組織中細胞間基質的膠原蛋白，導致血管壁受損并導致血液外滲。膠原酶有很多種，其中IV型和VII型細菌膠原酶廣泛用于腦出血動物模型的制備，目前還沒有研究報道它們之間的差異[18]。1993年，Rosenberg等[19]首次報道了膠原酶誘導的腦出血模型。該模型的缺點是膠原酶誘導的腦出血形成時間較長，且血腫為彌漫性滲血與腦組織的混合物。它并非完全的血腫，故與臨床腦內血腫的急性發生存在一定差距。為此，一些學者通過向大腦注射膠原酶和肝素混合物來改善這一點。據研究該模型注射后比較單純膠原酶注射血腫區形成，血腫大小基本一致，神經行為學顯示偏癱提前。這種改進的優點是可以顯著減少產生相同大小的血腫所需的膠原酶的量。另外研究中觀察到加入肝素后致出血時間延長，血腫迅速形成，形狀一致，可重復性高。

該方法主要應用于大鼠。有國內學者曾報道將該方法應用于兔，成功造出了兔腦出血模型，據報道，兔內囊出血可在注入膠原酶30 min內引起，效果穩定[20]。該學者采用微量注射器抽取膠原酶配置液6 μL，其配置比例為(VII型膠原酶0.2 U+肝素2 U)/μL，需要在5 min內緩慢注入兔腦組織，停針2 min后慢慢取出針頭。注射膠原酶30 min后，固定腦并取出冠狀切片，可觀察到明顯的腦出血。組織切片顯示大量紅細胞從血管中漏出。行為學方面觀察到兔在注射膠原酶4 h后具有肢體運動障礙，身體扭曲到一側，詳細的觀察顯示兔的舌頭是歪斜的，舌頭會伸到病變肢體的對側[20]。

膠原酶注入法誘導腦出血，操作簡單，出血量容易控制，周期短。其優點是可以更好地模擬人類自發性顱內出血和出血后血腫不斷擴大的動態過程，該模型的成功率和穩定性較高，但該模型的缺點是膠原酶誘導的腦出血主要是滲出，而不是完全血腫。臨床上見到的腦血管破裂引起的腦出血與之有一定的差距，且炎癥反應明顯，不適合研究腦出血后炎癥反應的機制[21]。與自體血注入腦出血模型相比，該方法對腦組織具有直接的細胞毒作用。該方法使血腦屏障受損更嚴重，神經功能缺損程度也更重，恢復時間更長。因此動物實驗中多用此來研究腦出血后的水腫情況或藥物治療后的預后觀察。

1.3 創傷致腦出血模型

通過外部打擊暴力的方法造成兔的顱腦外傷，從而導致顱內血腫形成。該方法所受暴力不可量化加之個體差異影響，導致顱內血腫形成時機、大小、部位無法預測，且動物易多發傷、心跳驟停，需心肺復蘇、開通靜脈通道及時搶救等，對實驗人員要求高耗費大且造模成功率不穩定[22-24]，造模成功率低且可重復性差[25]，導致在兔腦出血動物模型建造中受限。

1.4 兔腦出血模型的其他方法

通過刺破大腦中動脈制作腦出血模型是近年來隨著影像技術的進步新興的一種方法。據報道，2005年，周宇騰等人[26]實施了數字減影血管造影(digital subtraction angiography, DSA)介導下的犬大腦中動脈穿刺術，成功制作了腦出血模型。該方法可以在很大程度上模擬人腦出血中血管破裂的過程，但該方法成本高，操作者需要高技術并且易受輻射的影響。基于輻射安全因素考慮，2012年周璇等[27]首次應用超聲介入方法制作腦出血模型，大腦中動脈的主要分支在超聲引導下被針刺引起出血，類似于人 ICH中的血管破裂。然而，限于聲學特性，超聲引導的ICH模型需要開放骨窗，其對動物具有很大的損害并且出血量不固定。該方法與缺血誘發腦出血[28]、腦血管撕脫誘導腦出血模型[29]主要見于應用于大型動物如犬類、豬類等，在小動物腦出血模型上應用較為罕見。偶有學者曾在白兔上利用顯微鏡下用特制刀片鉤破大腦中動脈制作腦出血模型，實驗中共使用50只兔制作腦出血模型，實驗前期4 d共死亡8只兔，前期死亡率偏高導致長期存活率受限[30]。

2 兔腦出血模型的評估方法

兔腦出血模型建立后，成功與否可從多方面評估，如：行為學評分、大體解剖、影像學(多為頭顱CT或MRI)、病理學等。行為學方面：目前無針對兔腦出血的行為學評分，兔腦出血的實驗中多采用犬腦卒中、鼠腦卒中的評分，目前兔腦出血實驗中應用較多的為Purdy評分法(犬)[31]、Longa法(鼠)[32]；大體解剖方面：一般為處死兔后斷頭取腦、切片，進針層面多可見血腫形成表示造模成功，切片可放置于計算掃描儀下計算血腫面積(S)，進而累加計算血腫體積，公式為血腫體積(μL)=(S1+S2+S3+…+Sn)×總掃描片數×0.5/2[4]；影像學方面：CT、MRI在兔腦出血造模評價中較常應用[33]，影像學中可見到異常出血灶密度影存在，若與進針部位相符，即可證明血腫存在，優點是無創、快速、便捷，并可通過影像測量計算血腫體積，多采用Tada公式(出血量=長×寬×高×0.5)[12]；病理方面：評價腦出血造模成功與否的金標準，兔斷頭取腦，腦組織置于福爾馬林中固定、石蠟包埋、切片、HE染色，切片可見出血灶內大量變形紅細胞，邊緣可見炎性細胞，周邊可見壞死神經細胞和及膠質細胞，即可通過病理證明兔腦出血造模成功。

3 小結

相比于兔腦出血模型，大鼠腦出血模型更為成熟及在實驗中使用數量、分組存在一定的優勢，但從手術操作、標本收集、影像學評價、長期預后觀察等方面來看，大鼠腦出血模型有局限性，而兔有更大的優勢，原因如下：①相比大鼠，兔腦生理解剖更接近人腦，人腦腦出血多發生于基底節區，而兔腦基底節區較為發達，制作基底節區腦出血模型較為方便。②兔腦平均腦容量為30 g，大鼠平均為6 g，相差五倍[34]，大鼠腦容積小，造模成功后腦血腫測量及影像學評價較為困難；而兔腦大小適中，便于磁場處理和CT掃描[30]，腦出血后影像的變化、腦出血后周圍腦組織的灌注、測量腦血腫范圍的實驗中較常用到兔模型。③兔腦容積大，手術操作、標本收集較為方便，實驗中比較腦血腫清除術的效果時常用到兔模型，加之兔靜脈表淺，便于采血、監測血清指標及開通靜脈通道維持術中生命體征、便于搶救[4]。④兔性情溫和，腦出血多為一側肢體癱瘓，一般無其他損害，易于長期飼養、觀察[30]，可為大型動物(如狗、猴)腦出血建模提供參考依據。

本文中提到的刺破大腦中動脈制作腦出血模型、創傷腦出血模型由于各自的局限性，目前較少用于兔腦出血實驗研究。總體來說，自體血注入腦出血模型和膠原酶誘導腦出血模型是兔腦出血實驗中兩種較為常見的建模方法。如果觀察腦出血的早期形成和病理生理變化，則自體血注入法更為合適，如果觀察長時間過程的功能預后，則應選擇膠原酶誘導模型。在兔腦出血模型的構建中，前者更為經典和成熟，膠原酶誘導的腦出血模型在大鼠腦出血模型的構建中應用相對較為成熟，而在兔腦出血模型建造中應用相對較少，故膠原酶在兔腦出血模型中的應用劑量、注射速度、注射時間、留針時間尚無統一定論，可進一步研究探索。