復方苦參注射液質量控制方法研究進展

1.天津中醫藥大學中藥制藥工程學院，天津 300193； 2.浙江大學藥物信息學研究所，浙江 杭州 310058； 3.山西振東制藥股份有限公司，山西 長治 047100

復方苦參注射液(Compound Kushen Injection, CKI)是由苦參、白土苓兩味藥材經滲漉、煎煮、醇沉等一系列精制工藝而制成的中藥注射劑，收載于衛生部藥品標準[1]。CKI具有清熱利濕、涼血解毒、散結止痛之功效[2]。常用的質量分析方法包括薄層掃描法、高效液相色譜法和毛細管電泳法等，檢測指標多為苦參堿、氧化苦參堿、槐果堿、槐定堿和氧化槐果堿等生物堿類化合物，主要來源于苦參藥材，另有來源于白土苓的大澤米苷，報道較少。本文對文獻報道的CKI質量控制技術進行調研，分析各方法的優勢與不足，以期為建立該品種更為完善的質量控制體系提供參考。

1 復方苦參注射液質量控制方法

1.1 酸堿滴定法 酸堿滴定法是利用酸堿反應并通過滴定操作測定物質含量的一種分析方法，是一種經典含量測定技術，但由于某些物質溶解度較差，在水中進行酸堿滴定受到一定限制，常需要采用各種非水溶劑作為介質進行滴定[3]。CKI的部頒標準采用酸堿滴定法測定苦參總堿的含量。步驟如下：精密吸取本品0.5 mL，置于100 mL具塞錐形瓶中，置水浴上蒸干后，加濃氨試液0.35 mL使溶解，然后加氯仿20 mL，密塞，搖勻，室溫放置過夜，置水浴上蒸干，殘渣加中性乙醇(對甲基紅指示劑顯中性)5 mL使溶解，蒸干，殘渣加乙醚6 mL使溶解。精密加硫酸滴定液(0.01 mol·L-1)10 mL，搖勻，置水浴上加熱使殘渣完全溶解并除盡乙醚，放冷。加新沸過的冷水20 mL與甲基紅指示劑2滴，用氫氧化鈉滴定液(0.02 mol·L-1)滴定至橙黃色，結束滴定。每1 mL的硫酸滴定液(0.01 mol·L-1)相當于4.976 mg的苦參堿(C16H24N2O)[4]。這種方法測定苦參總堿的含量，可彌補單個生物堿含量測定的不足，但是操作煩瑣、專屬性差、成本高、時間長，對操作人員的技術要求也較高，限制了該方法的廣泛應用。

1.2 薄層色譜法 薄層色譜法系將適宜的固定相涂布于玻璃板、塑料或鋁基片上，形成均勻薄層。待點樣、展開后，根據比移值與適宜的對照物按同法所得的色譜圖的比移值作對比，用以進行藥品的鑒別、雜質檢查或含量測定的方法。宋茹等[5]采用用薄層掃描法對CKI中苦參堿進行了含量測定，以甲苯-丙酮-乙醇-氨水(10∶10∶1∶0.1)為展開劑，在CS -9000 飛點薄層掃描儀上以反射式鋸齒掃描方式(λ=515 nm)進行測定，結果表明：樣品含量在2.16～7.56 μg范圍內呈良好線性關系，決定系數為0.9992，平均回收率達到99.0 %，RSD為0.61%(n=6)。該法簡便快速、重現性滿意，但是需要專用設備，耗時也較長，不適合大量樣本的采集和分析。

1.3 氣相色譜法(GC) GC的分析原理是使混合物各組分在固定相和流動相之間進行分配，當流動相中所含的物質經過固定相時，就會與固定相發生相互作用。由于各組分性質和結構上的不同，相互作用的大小、強弱有差異，因此在同一推動力作用下，不同組分在固定相中滯留時間有一定差別，從而按移動速度大小次序依次從固定相中流出。

江林等[6]建立了填充柱氣相色譜測定苦參及其制劑中的苦參堿類生物堿的方法。該方法采用1 m長的OV-17色譜填充柱，檢測器及汽化室溫度設為320 ℃，升溫方式為150 ℃→250 ℃(250 ℃，保持3 min)、250 ℃→300 ℃(300 ℃，保持2 min)、升溫速度均為20 ℃·min-1的實驗條件。該方法對由數種中草藥(含苦參)組成的醇提取液有滿意的精密度(RSD=1.9%,n=11)及回收率(98.3 %)。通過對苦參堿、氧化苦參堿的填充柱色譜行為與毛細管柱色譜-質譜行為對比，得知填充柱色譜峰為苦參總堿。該方法可應用于各種苦參制劑中苦參總堿含量的直接測定以及原藥采集和生產過程中的質量監測，在當時被某生產以苦參為主要制劑成分的企業所采用并編入企業標準，成為其原料采集、生產監控和成品檢驗的主要手段，取得了當地技術監督部門的認可。該技術測定的仍是苦參總堿的含量，不能分別測定各種單體生物堿的含量，而且由于苦參生物堿類化合物揮發性并不理想，未必適合進行GC測定。

1.4 毛細管電泳法(CE) CE技術兼有電泳和色譜技術的雙重優點，該技術以毛細管為分離通道，以高壓直流電場為驅動力，以樣品的多種特性(電荷大小、等電點、極性、親和行為、各組分之間淌度、相分配特性等)為依據的液相分離分析技術。饒毅等[7]采用CE法測定了CKI中苦參堿、氧化苦參堿、槐定堿的含量。采用未涂層石英毛細管(57 cm×50 μm i.d.)作為分離通道，分離電壓為12.5 kV，緩沖體系為：0.2 mol·L-1Tris-40 mmol /L磷酸二氫鈉(pH 5.50)-20%異丙醇，檢測波長設為200 nm，以氫溴酸東莨菪堿為內標，緩沖液中添加有機改性劑可以顯著改善分離。CE已日益廣泛地應用于中藥化學成分的分離和含量測定，該法簡便快速，有較好的重現性，而且分析成本較低，并可減少有毒試劑(包括流動相)的使用，可作為許多中藥有效成分的分離和質量控制方法。

1.5 高效液相色譜法(HPLC) HPLC法作為一種高效、快速的分離、分析技術，以其靈敏度高、選擇性好，可分析微量組成甚至痕量樣品等特點，成為醫藥分析領域應用最為廣泛的現代分析技術之一。王智民等[8]建立了同時測定CKI中苦參堿、槐定堿和氧化苦參堿的含量的HPLC方法，所用色譜柱為Alltimaamino色譜柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)、流動相為乙腈-3%磷酸溶液-無水乙醇(80∶10∶10)、流速為1.0 mL·min-1、柱溫為30 ℃、檢測波長為220 nm，方法回收率：苦參堿為99.5%(RSD=1.58%)，槐定堿為99.2%(RSD=1.44%)，氧化苦參堿為100.2%(RSD=1.85%)。研究過程中曾嘗試嘗試將注射劑直接稀釋進樣，但發現樣品溶液在上述色譜條件下雜質干擾較強，3種生物堿無法得到基線分離。故采用濃氨水將注射劑調為堿性，使生物堿游離出來后，用氯仿少量多次萃取，揮干氯仿，無水乙醇稀釋進樣，苦參堿、槐定堿和氧化苦參堿均能得到良好分離。

反相離子對色譜法是把離子對試劑加入到含水流動相中，被分析的組分離子在流動相中與離子對試劑的反離子生成不帶電荷的中性離子，從而增加溶質與非極性固定相的作用，使分配系數增加，改善分離效果。反相離子對色譜法無需衍生或使用特殊色譜柱，具有反相色譜法操作簡便和分離柱效高等固有優點。張蕾等[9]建立了同時測定CKI中氧化苦參堿和苦參堿含量的方法，方法采用離子對RP-HPLC法，實驗條件為Hypersil ODS2色譜柱(200 mm×4.6 mm, 5 μm)、流動相為甲醇-乙腈-水-磷酸(10∶ 30∶65∶0.05)，含33m mol·L-1的SDS)、流速為1.0 mL·min-1、檢測波長設為210 nm、柱溫為室溫。實驗考察了酸度和離子對試劑種類對組分色譜行為的影響，結果表明，庚烷磺酸鈉的分離效果較好，但該試劑價格昂貴，因而選用了價格相對較低的十二烷基硫酸鈉，結果顯示氧化苦參堿、苦參堿分別在17.44～174 .4 μg· mL-1(r=0 .9996,n=6)和1.96～39.20 μg· mL-1(r=0 .9997,n=6)范圍內呈良好線性關系，平均回收率分別為100.4%(RSD=2.1 %,n=9)和99 .7 %(RSD=1.4 %,n=9)。陳晨等[10]建立反相離子對色譜同時測定CKI中苦參堿、槐果堿、氧化槐果堿和氧化苦參堿含量的方法，該方法采用Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm, 5.0 μm)色譜柱、流動相為0.04%磷酸-10 mol·L-1戊烷磺酸鈉水溶液和乙腈、線性梯度洗脫、流速為1.2 mL·min-1、柱溫30℃、檢測波長 210 nm的實驗條件，實驗分別嘗試了在流動相中加醋酸、氨水、三乙胺、磷酸鹽、十二烷基磺酸鈉、戊烷磺酸鈉等添加劑，結果十二烷基磺酸鈉和戊烷磺酸鈉離子對試劑均能明顯改善4個生物堿峰的峰形，而戊烷磺酸鈉能使4個生物堿實現良好分離，最終選擇以戊烷磺酸鈉離子對試劑為添加劑。實驗結果得到苦參堿、槐果堿、氧化槐果堿和氧化苦參堿質量濃度分別在18.92～946.0 mg·L-1，4.052～202.6 mg·L-1，9.293～464.6 mg·L-1，34.73～1736 mg·L-1范圍內線性關系良好，相關系數均為0.9999；重復性試驗中4個生物堿的RSD均小于2.1%；平均加樣回收率分別達到98.2%，96.4%，96.9%，97.1%。

HPLC方法為CKI質量控制的經典方法，該方法可將各種生物堿進行有效分離后進行準確測定，一般也作為標準方法使用。但生物堿類化合物在樣品中以分子態和離子態兩種形式共存，必須通過嚴格控制pH值或加入對離子的方式，維持其分子態，從而可在色譜柱上保留，因此測定過程較為復雜，分析工作效率不夠理想。

1.6 液相色譜-質譜聯用(HPLC-MS) HPLC-MS是以液相色譜作為分離系統，質譜為檢測系統的一種分析技術，它集HPLC的高分離能力和MS的高靈敏度、高選擇性于一體，彌補了傳統液相檢測器的不足，尤其適用于在紫外區域無特征吸收，或含量較低的化合物的分析測定。劉倩等[11]建立了含苦參的復方制劑HPLC-MS鑒定方法。其中，液相色譜采用梯度洗脫，質譜用正離子模式檢測。主要的實驗條件如下：色譜柱：Hypersil BDS(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：A：0.1氨水，B：甲醇；梯度洗脫：0 min：A：B(80∶20)，30 min：A：B(80∶20)，50 min：A：B(40∶60)，流速設為0.5 mL·min-1，共從CKI中分離鑒定了11種化學成分，其中苦參堿、氧化苦參堿、槐定堿、氧化槐果堿均為苦參堿型生物堿，此外尚有金雀花堿型、無葉豆堿型、羽扇豆堿型生物堿以及大量的同分異構體。在上述色譜條件下，采用苦參堿、氧化苦參堿、槐定堿、氧化槐果堿標準品進行確證，結果發現4種標準品色譜圖和質譜圖同上述復方苦參堿注射液中對應成分在保留時間，準分子離子和碎片離子吻合，驗證了上述結果的準確性。

HPLC-MS法集色譜分離及質譜定性檢測能力于一體，對于復雜混合物具有良好的分離和表征能力，可以簡便快速的獲得各化合物的分子結構信息，進行定性分析。本法簡便，快速，可用于中藥復方化學成分的分析。但儀器價格昂貴，分析成本較高，不適于大批量樣品的日常分析檢測。

1.7 近紅外(Near infrared, NIR)光譜法 目前，對復方苦參注射液的質量控制研究均需要復雜的樣品預處理，成本高，時間長，不太適合CKI生產過程中中間體的快速分析，而注射液生產過程中中間體的快速分析對于產品的過程質量控制是非常重要的。在此背景下，NIR光譜分析技術成為一種新的選擇，該技術通過選擇適當的化學計量學方法，把校正集樣品的NIR吸收光譜與其成分濃度或性質數據進行關聯，建立二者之間的定量校正模型。在進行未知樣品預測時，應用已建好的校正模型和未知樣品的吸收光譜，就可定量預測其成分濃度或性質，該技術具有快速，同時測量多種理化性質、綠色環保及操作方便等特點。

陳晨等[12]建立了CKI生產過程中兩類中間體(醇沉液和堿沉液)中4 種生物堿含量的快速測定方法，探討中藥制劑中間體質量控制的有效途徑。研究分別采用NIR透射和透反射模式采集樣品光譜，比較不同光譜采集方式的建模效果并優選出最佳建模參數，在此基礎上采用偏最小二乘回歸(PL-SR)算法建立NIR光譜與參考值之間的校正模型，并對未知樣品的含量進行預測。實驗結果表明，建立的苦參堿、槐果堿、氧化槐果堿和氧化苦參堿模型性能良好。醇沉液模型的預測誤差均方根(RMS-EP)分別為：0.131 g·L-1、0.0279 g·L-1、0.170 g·L-1、0.613 g·L-1；堿沉液模型則分別為0.0723 g·L-1、0.0155 g·L-1、0.0768 g·L-1、0.220 g·L-1。該團隊還報道采用NIR透反射光譜技術，對CKI滲漉液中多組分的量進行快速測定[13]。該方法采用氧化槐果堿、氧化苦參堿的HPLC 測定值，總糖的苯酚-硫酸法測定值及固體總量的烘烤法測定值為對照值，用偏最小二乘法建立近紅外光譜與對照值之間的校正模型，并對未知樣品進行定量預測。結果表明，校正模型對氧化槐果堿、氧化苦參堿、總糖和固體總量4 種組分的交叉驗證均方根誤差(RMSECV)分別為43.5、135.4、1255.7 mg·L-1和150.7 mg· mL-1，經外部驗證，預測均方根誤差(RMSEP)分別為32.5、191.7、1 461.9 mg·L-1和164.0 mg· mL-1。證明所建模型具有滿意的擬合效果和預測能力，目前已用于復方苦參注射液滲漉過程的快速分析。與傳統測定方法相比，NIR光譜技術耗時短，測定結果準確，無需樣品預處理，大大節約了時間和成本，尤其適用于大批量樣品的快速分析，且可通過光纖實現遠程測定和在線測定，在工業生產上極具推廣應用價值。

2 結語

本文簡要介紹了復方苦參注射液質量控制的7種方法，并對其優缺點進行評述。目前復方苦參注射液的質量控制還局限于測定源自苦參藥材的一些生物堿類化合物，而白土苓作為一味原料藥材，其質量標志物(Q-Marker)并未在最終產品的質量控制中得以體現，這復方苦參注射液質控技術的主要不足之處。復方苦參注射液生物堿類化合物的含量測定目前主要采用HPLC方法，但仍需要探索采用新型色譜柱和新的樣品預處理方法，以簡化操作步驟，提高分析效率。CE技術也可以用于測定CKI 中生物堿類化合物含量，成本低、效率高，是一種新的選擇。NIR光譜技術作為一種復方苦參注射液質量控制的新型的方法，具有耗時短、測定結果準確、可實時在線監控等優勢，適應了工業分析的需求，大大節約了時間和成本，適用于大批量樣品的分析，非常適合于中藥中間體的檢測及復方苦參注射液的全程質量控制。