豬場疫苗免疫效果監測評估

張愛瓊 ，曾智勇，梁海英，王 彬，咸 文，何小莉，陳 娟，吳好葉，黃二素

（貴州大學動物科學學院，貴州 貴陽 550025）

1 死亡率和日增重

死亡率和日增重是豬場疫苗免疫效果檢驗中重要的指標，是指在疫苗免疫后的相同時間間隔內對免疫豬只的死亡率和日增重進行統計分析，是免疫后對疫苗效果檢驗的重要手段之一。李軍[1]設計7組試驗，每組22頭體重差異不大的仔豬，1～5組為試驗免疫組，剩余6～7組為空白對照組，在首次免疫后隨著日齡的增加，組間差異增大，試驗免疫組較空白對照組日增重差異顯著，疫苗免疫對豬只的保護最終優化了料重比。

2 PCR檢測法

PCR檢測方法是一種DNA體外擴增法，在實驗室檢測中具有快速、靈敏、準確的特點，可以對病毒DNA進行特異性擴增，以檢測豬只感染所產生的病毒血癥。李長海等[2]使用PCV2亞單位疫苗和PCV2全病毒滅活疫苗將1 000頭仔豬分3組進行疫苗免疫效果研究，并在首免前和免疫后30 d、60 d、90 d采血分離血清，使用核酸提取試劑盒提取血樣核酸，采用TaqMan熒光定量PCR檢測方法對血樣中PCV2病毒含量進行檢測。結果顯示，PCV2亞單位疫苗免疫組仔豬血樣中PCV2病毒含量最少，免疫PCV2全病毒疫苗組病毒含量次之，對照組中PCV2病毒含量最多。PCR檢測方法靈敏度高，可對病原進行快速特異性檢測，疫苗免疫后對病毒血癥及時檢測也至關重要。

3 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測

抗體檢測是最常規也是檢驗疫苗免疫效果的最經典方法，酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測方法是抗體檢測中最快速有效的方法，是將特異性抗原進行包被后測定疫苗免疫后血清中的抗體效價，該方法操作方便，能夠快速進行抗體檢測。Gu Z等[3]為研究PRV疫苗的免疫效果，使用15頭4周齡仔豬（不含 PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV），每組5頭仔豬，隨機分成3組，第1組用PRV Bartha-K61疫苗接種，第2組用滅活的PRV vZJ01ΔgE/ gI疫苗接種，第3組為對照組，用PBS接種。在接種14 d后用相同的方法進行加強免疫接種，并在接種7 d、14 d、21 d、28 d、35 d收集血樣，用ELISA和血清病毒中和試驗（NT）對PRV的抗體進行測定。結果顯示，在免疫后4～5周，滅活的PRV vZJ01ΔgE/ gI疫苗免疫豬比用Bartha-K61疫苗接種的豬產生顯著更高的特異性免疫應答（P＜0.05），

但抗體水平顯示PRV vZJ01ΔgE/ gI疫苗組和Bartha-K61組相似。李英等[4]對山東日照市8個養豬采集240份樣品通過ELISA檢測試劑盒進行PRV抗體檢測，結果顯示240份樣品中有195份免疫合格，合格率達到81.25%，達到國家規定的抗體水平。ELISA檢測方法，操作過程簡單，不需要復雜的試驗設備和條件，可用于豬場抗體的快速檢測。

4 中和抗體檢測

血清中和測定法可評估血清樣品的中和能力，檢測血清中的抗體效價。Zhang H等[5]選用16頭5周齡雜交斷奶仔豬（CSFV呈血清陰性）對IFN-γ作為免疫佐劑的CSFV E2亞單位疫苗保護性進行研究。實驗分成4組，每組4頭仔豬，A組豬（陰性對照組）肌內 注 射2 mL PBS，B組（ 陽 性對照組）的豬肌內注射單劑量的商業C-株疫苗，C組和D組的豬分別肌內注射2 mL E2和E2-IFN-γ亞單位疫苗，進行中和實驗測定。所謂中和測定，即將血清樣品在56 ℃下熱滅活30 min，連續稀釋2倍，然后在100 ℃下與100 TCID50CSFV Shimen菌株混合60 min。將血清-病毒混合物加入在96孔板中培養的匯合PK-15細胞中，然后在37 ℃下孵育3 d，用PBS洗滌PK-15細胞3次，并用冷的80%丙酮固定30 min，然后將固定的細胞與E2 MAb（1∶100稀釋）一起，在37 ℃下溫育 1 h。然后用PBS洗滌3次，將細胞與異硫氰酸熒光素（FITC）標記的山羊抗小鼠IgG在37 ℃溫育1 h，然后用PBS洗滌3次，在熒光顯微鏡下觀察。結果顯示，C-菌株、E2和E2＋IFN-γ基團誘導CSFV產生的中和效價更高，但在初次免疫后28 d，這3組之間沒有觀察到顯著差異（P＞0.05），中和滴度在14 d達到峰值，C-菌株組的平均中和抗體滴度為1∶304，E2亞單位疫苗組為1∶362，E2＋IFN-γ亞單位疫苗組為1∶608。在整個實驗中在E2和E2＋IFN-γ組之間沒有觀察到中和抗體滴度的顯著差異。

5 酶聯免疫斑點檢測

酶聯免疫斑點檢測是用抗體對細胞分泌的細胞因子進行捕獲，并以酶聯免疫斑點的形式顯現出來。Oh T等[6]對4種韓國PRRSV商品化疫苗（Porcilis PRRS、UNISTRAIN PRRS、Ingelvac PRRS MLV、Fostera PRRS）免疫效果進行研究。其選用28日齡的200頭仔豬，每40頭豬分為1組、共分5組，分別為Vac1A組免疫Porcilis PRRS、Vac1B組免疫UNISTRAIN PRRS、Vac2A 組 免疫ngelvac PRRS MLV、Vac2B組免疫Fostera PRRS和對照組注射等體積的PBS，并采用酶聯免疫斑點免疫效果評估，即在外周血單核細胞（PBMC）中測定用從農場分離的野外病毒刺激的PRRSV特異性干擾素 -γ分泌細胞（IFN-γ-SC）的數量。將接種于（5×105個PBMC /孔）的PBMC用MARC-145細胞裂解物（感染復數等于0.01）作為回憶抗原刺激20 h，在37 ℃，5 % CO2的條件下孵育。 使用自動酶聯免疫斑點（ELIPOT）測定ELISPOT讀數器對膜上的IFN-γ陽性斑點進行成像，分析和計數。結果顯示，與未接種組相比所有4個接種組的仔豬在PBMC中具有顯著（P＜0.05）更高數量的PRRSV-1和PRRSV-2特 異 性 IFN-γ-SC（ UnVac） 在21 d、56 d和84 d。 在56 d和 84 d時，Vac1A和Vac1B組與Vac2A和Vac2B相比豬在PBMC中具有顯著更 高（P＜ 0.05） 的 PRRSV-1特異性IFN-γ-SC 數量。在21 d、56 d和84 d時，Vac2A和Vac2B組 與Vac1A和Vac1B組相比豬在PBMC中具有顯著更高（P＜0.05）的PRRSV-2特異性IFN-γ-SC數量。最后，在84 d時Vac2B組與Vac2A組相比，豬在PBMC中具有顯著更高（P＜0.05）的PRRSV-2特異性IFN-γ-SC數量。該方法靈敏度較高，比傳統的ELISA方法靈敏度高很多，操作方面可進行高通量檢測。

6 攻毒試驗

攻毒保護試驗是評價疫苗免疫效果最直接的方法，抽取一定數量的免疫豬只，用于疫苗對應的強毒病原微生物進行人工感染，檢測疫苗的免疫保護效果。陳果亮[7]選取34日齡斷奶仔豬50頭，隨機分5組，每組10頭，A、B、C、D組接種不同廠家豬瘟疫苗免疫，E組作為空白對照組。在A、B組疫苗免疫后第7天后進行攻毒，肌注（1 mL）1×104TCID50石門豬瘟強毒，同時對疫苗空白對照E組進行同等劑量攻毒。攻毒后每天對豬只溫度和臨床變化進行測定，試驗豬只在攻毒后14 d進行全部剖檢，進行組織病理性和病毒核酸檢測。結果顯示，免疫豬瘟疫苗組在進行攻毒后沒有出現明顯的臨床變化，豬只體溫正常，疫苗免疫空白對照組在攻毒后2 d，豬只出現高熱稽留，其中1頭急性發病于攻毒后第9天死亡，其他豬只食欲下降、精神沉郁，皮膚出現豬瘟出血點或出血斑癥狀，攻毒后14 d對照組豬只全部死亡，對免疫組和對照組進行剖檢觀察，對照組出現典型的豬瘟病理變化，而免疫組臟器未見變化。其研究結果表明，豬瘟疫苗的疫苗免疫效果明顯，保護率高。

7 總結

近年來，許多病原嚴重影響養豬業的發展，如我國新出現的非洲豬瘟就給養豬業帶來了巨大的經濟損失。疫苗免疫接種是防控傳染病的重要手段[8]，規模化的養豬場更要做好豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征、豬圓環病毒病等疫苗免疫工作，定時進行監測，加強飼養管理做好衛生清潔工作，堅持預防為主的養殖模式。建立疫苗免疫檢測體系，避免因疫苗失效、疫苗劑量不足、藥物刺激、功能性疾病、免疫方法等不當導致的免疫失敗[9]，使我國養豬業健康、穩定的發展。