膽堿能抗炎通路在子癇前期患者母胎界面的表達及意義

鄭林媚 施蕾 周忠義 陳小菊 王莉 唐榮 盧志誠

子癇前期(preeclampsia，PE)是妊娠期特有且常見疾病，是產科中導致母兒發病率和死亡率的主要原因[1]，其病因和確切發病機制至今尚未闡明。目前普遍認為子癇前期是一種母體系統性的過度性炎癥反應，主要表現為母胎界面與炎癥反應及細胞因子有關的炎性細胞激活、血管內皮細胞的功能紊亂和損傷以及滋養細胞的遷移受限、淺著床。Borovikova在2000年首次提出“膽堿能抗炎通路(cholinergic anti-inflammatory pathway, CAP)”[2]，即炎癥刺激信號通過迷走神經傳入，經中樞神經系統將信息整合后，傳出至神經末梢釋放乙酰膽堿(acetylcholine, ACh)，作用于炎癥細胞上的α7 煙堿型乙酰膽堿受體(alpha-7 nicotinic acetylcholine receptor, α7nAChR)，抑制促炎細胞因子釋放。研究證實子癇前期患者較正常妊娠孕婦晚期ACh增加，推測膽堿能抗感染通路可能與子癇前期發病之間有一定聯系[3]。但該通路在子癇前期中是否發揮作用以及如何作用，目前尚不清楚。本試驗旨在通過測定正常妊娠孕婦和子癇前期患者胎盤組織中α7nAChR及核因子-κB(nuclear factor-kB，NF-κB)的表達水平及相關炎癥因子的變化及其意義，探討膽堿能抗炎通路與子癇前期的關系，為研究子癇前期發病機制及防治策略提供新的概念和理論依據。

對象與方法

一、研究對象

選擇2015年1月～2016年1月海南省人民醫院醫院婦產科住院分娩的子癇前期患者60例，其中輕度子癇前期30例，重度子癇前期30例。選擇同期正常孕婦30例為對照組。子癇前期組孕婦均因病情需要行剖宮產術終止妊娠，對照組孕婦均因社會因素行剖宮產術終止妊娠。子癇前期的診斷與分類參照謝辛主編的第8版《婦產科學》[4]。孕婦年齡、孕產次和孕前BMI比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，重度子癇前期組孕婦孕周與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。所有病例均無其他產科并發癥及內外科合并癥。胎盤組織標本經患者獲取知情同意書后進行。

Table 1 Clinical characteristics of all participants

Note:*compared to control,P< 0.05

二、研究方法

1.標本采集

胎盤娩出5 min內取胎盤標本，在胎盤中央母體面靠近臍帶血管處(避開出血、梗死和鈣化區)，取胎盤組織塊大小約2 cm × 2 cm ×2 cm，一塊用生理鹽水漂洗后，置于無RNA酶的無菌凍存管中，于-80 ℃冰箱中保存；另一塊用 10% 中性福爾馬林液固定，制備石蠟切片。

2.qRT-PCR定量檢測胎盤組織α7nAChR mRNA的表達

按Trizol 試劑的使用操作步驟提取胎盤組織總RNA，進行RNA 的瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的純度。以β-肌動蛋白(β-actin)基因為內參，按照 Thermo公司 RevertaidTM First Strand cDNA Synthesis Kit 說明書，將各樣本總RNA進行反轉錄為cDNA。接著應用 SYBR Green I 熒光染料技術行實時定量 PCR 反應， 以 cDNA 為模板，建立RT-qPCR 反應體系，總的反應體積是20 μl。α7nAChR的TaqMan探針由北京君諾德生物技術有限公司設計并合成引物，α7nAChR上游引物序列5′- TTT CGT TTC ATG CAC TGG ACC CC-3′，下游引物序列5′- GGT TGC GAT TGG CGA ACC TGT TC-3′；β-actin上游引物序列5′- CCC AGA ATC TAC TAT CAC GAG TAC GAC GC -3′，下游引物序列5′- AAT CAC GAC GAT CGC ATA TTT ACG CAA CA-3′。根據PCR 產物熔解曲線的平均熔解溫度確定產物的純度。以Ct 值校正目的基因Ct 值,實驗結果采用2﹣ΔΔCt法,計算目的基因mRNA 轉錄水平的差異。

3. Western-blot法檢測胎盤α7nAChR蛋白的表達

嚴格按照試劑盒說明書提取胎盤總蛋白，以標準蛋白作為對照，酶標儀檢測OD值，計算蛋白濃度。經SDS PAGE凝膠電泳后轉PVDF 膜后在封閉液中封閉2小時，隨后加入1∶800一抗孵育24 h ，二抗孵育1∶1000 2 h，漂洗濾膜后加入DAB顯色劑顯色，晾干硝酸纖維素膜，在凝膠成像系統上拍照，結果用Image J軟件分析，以目的條帶密度與β-actin光密度比值作為目的條帶的相對參數。

4.免疫組化方法檢測胎盤組織NF-κB的蛋白表達

將石蠟切片進行脫蠟和水化，并進行抗原修復，加入內源性過氧化氫阻斷劑孵育10 min，隨后加入1∶200兔抗人NF-κB65 37℃孵育60 min，再滴加增強1∶500酶標山羊抗兔 IgG聚合物孵育20 min，最后DAB顯色，蘇木素復染，鏡下觀察。NF-κB陽性表達的判定：細胞核、細胞質中染有棕黃色、褐色顆粒，計算陽性細胞百分比評分，5%為0分，5%～20%為1分，20%～50%為2分，50%～75%為3分，75%為4分；無著色0分，淺黃色1分，黃色2分，深黃色3分。兩者相乘，0分為陰性，1～4分為+，5～8分為++，9～12 分為+++，++，+++均視為陽性。

5.胎盤組織中白介素6(interleukin 6，IL-6)和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor α，TNF-α)蛋白的檢測

采用雙抗體夾心ELISA法測定母血中IL-6和TNF-α蛋白的表達。ELISA試劑盒購自南京巴傲得生物科技有限公司。操作嚴格按試劑盒說明書進行。所有樣品均設立復孔，均在同一批內檢測。

6.統計學方法

結 果

1.α7nAChR mRNA和蛋白在胎盤組織中的表達

輕度子癇前期組胎盤組織中α7nAChR mRNA的表達水平 (1.31 ± 0.12) 明顯高于對照組和重度組 (0.62 ± 0.10；0.41 ± 0.08)，而重度組明顯低于對照組，差異有統計學意義(P﹤0.05)。α7nAChR蛋白在輕度子癇前期患者胎盤組織中的表達水平(0.78± 0.11)高于對照組和重度組 (0.36 ± 0.07；0.20 ± 0.06)，與對照組相比較，重度組的α7nAChR蛋白表達明顯下降，差異有統計學意義(P﹤0.05)，見圖1和圖2。

2.免疫組化檢測NF-κB蛋白胎盤組織的表達結果

NF-κB65主要表達于胎盤組織滋養細胞、血管內皮細胞、少量間質細胞的胞質及胞膜，呈棕褐色顆粒。與對照組相比，輕度子癇前期胎盤組織中的NF-κB蛋白表達顯著上調(P<0.01)，其NF-κB陽性表達率為 56.7%(17/30)，高于對照組中的表達率26.7% (8/30)，存在統計學差異 (χ2=11.286，P<0.01)。重度子癇前期的NF-κB蛋白陽性表達率為83.3%(25/30)，與輕度子癇前期組比較，差異有統計學意義(χ2=14.464，P<0.01)，見表2和圖3。

Note:*compared to control，P<0.05; **compared to control，P<0.01; ##compared to mild preeclampsia，P<0.01Figure 1 Expression ofα7nAChR mRNA in the placenta

Note: *compared to control，P<0.05; **compared to control，P<0.01; ##compared to mild preeclampsia，P<0.01Figure 2 Expression of α7nAChR protein in the placenta

Table2Expression of NF-κB in distinct histological placental tissue

GroupNNF-κBnegative (-)positive (+)Control30228Mild preeclampsia**301317Severe preeclampsia##30525

Note:**compared to control，P<0.01;##compared to mild preeclampsia，P<0.01

3. ELISA法測定胎盤組織中IL-6和TNF-α的表達變化。

IL-6和TNF-α在子癇前期患者胎盤組織中的水平高于正常妊娠組，差異有統計學意義(P<0.01)，重度子癇前期組IL-6和TNF-α表達水平明顯高于輕度子癇前期組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表3。

Figure 3 Expression ofNF-κB protein in placentaNote:Immunohistochemistry analysis of NF-κB from placenta in preeclampsia (SP, × 200)(A:control group, B:mild preeclampsia; C:severe preeclampsia)

GroupN IL-6 TNF-αControl3028.12±9.1749.31±8.83Mild preeclampsia3037.65±11.34*60.12±10.16**Severe preeclampsia3063.42±8.21**/##80.55±12.14**/##

Note:*compared to control，P<0.05;**compared to control，P<0.01;##compared to mild preeclampsia，P<0.01

Figure 4 Possible mechanisms of cholinergic anti-inflammatory pathways in preeclampsia

討 論

子癇前期是妊娠特有多系統受累的疾病，是導致孕產婦和圍產兒死亡的主要原因之一[5]。近年來研究顯示子癇前期具有前炎性因子如細胞因子、趨化因子等過度表達的特征[6]。許多學者認為炎癥反應在子癇前期病理過程以及胎兒宮內生長受限，HELLP綜合征發揮著重要作用。膽堿能抗炎通路 (cholinergic anti-inflammatory pathways，CAP) 是指中樞神經系統與免疫系統之間存在一條能夠拮抗炎癥反應的通路，主要由迷走神經、ACh和α7-nAchR亞型構成，其機制為大腦識別傳入迷走神經傳來的信號，刺激迷走神經末梢釋放Ach，與免疫細胞上表達的α7-nAchR結合，抑制致炎細胞因子的合成與釋放，從而發揮抗炎作用[7]。

1986年Satyanarayana學者[8]發現合體滋養層細胞出現中度變性(如子癇前期、子癇和胎死宮內)，并伴有Ach合成表達明顯減少。Murthy等[9]通過測定子癇前期患者胎盤組織中的Ach水平，結果發現其Ach釋放明顯減少。據此，我們推測作為神經免疫調節的“膽堿能抗炎通路”可能參與其中。由Ach激活的α7nAChR是調節炎癥反應的關鍵性分子[10]。體外研究顯示：α 7nAChR受體在人臍靜脈和微血管的內皮細胞上有著豐富的表達。但在缺氧、煙堿刺激后，人臍靜脈內皮細胞α 7nAChR水平明顯升高[11]。但也有學者的研究結果發現在缺血缺氧狀態下，α7nAChR蛋白的表達下降[12]。本研究結果顯示，α7nAChR mRNA在正常孕婦和子癇前期患者胎盤組織中均有表達，輕度子癇前期孕婦胎盤組織中α7nAChR mRNA表達水平明顯高于對照組。有趣的是，進一步研究發現重度子癇前期組的α7nAChR mRNA與輕度子癇前期組相比明顯下降，且重度組低于對照組，差異有統計學意義。同時Western-blot檢測結果也證明與mRNA結果相一致，由以上研究可以推測能與Ach相結合的煙堿受體可能在子癇前期的發病過程中起一定作用。但與Rita Machaalani[13]等的結果并不一致，其研究結果發現子癇前期組中α7nAChR mRNA表達更高。分析認為這可能與作者未將子癇前期進行分類，如輕度型或重度型，及子癇前期狀態下缺血缺氧的嚴重程度和持續時間等有關。

NF-κB是炎癥因子基因表達的樞紐之一，被稱為前炎癥介質轉錄因子，激活諸如IL-1β、IL-6和TNF-α等的其他促炎細胞因子并擴增其他炎性介質，引起廣泛的過度性炎癥反應[14]。2001年Takcas就通過研究發現妊娠期高血壓疾病患者的血漿可使NF-κB激活，且比正常妊娠組孕婦的活性增加2.5倍[15]。大量的研究表明，CAP是通過α7nAChR介導的抗炎通路抑制NF-κB途徑完成的[16]。本研究結果顯示，子癇前期患者胎盤NF-κB蛋白表達較正常妊娠組顯著上調，且重度組的NF-κB蛋白表達明顯高于輕度組。我們進一步測定胎盤組織IL-6和TNF-α的水平，發現子癇前期組的IL-6和TNF-α水平明顯高于正常妊娠組，且重度組明顯高于輕度組，與之前的研究結果相一致[17]，提示炎癥因子激活參與了子癇前期病理生理過程，其表達強弱可以在一定程度上顯示子癇前期發生發展的嚴重程度。

子癇前期是個多因素、多機制的疾病，機體表現的炎癥反應是一種復雜、交叉調節、互相協調的過程，并且與氧化應激反應密不可分[18]，作用機制見圖4。本研究結果顯示輕度子癇前期狀態下，機體代償性激活膽堿能抗炎通路，α7nAChR表達增多，抑制NF-κB的激活，一定程度上抑制炎癥反應。因此輕度子癇前期組的IL-6、TNF-α的表達雖然高于正常妊娠組，但明顯低于重度子癇前期組。當進展到重度子癇前，局部胎盤組織存在氧化與抗氧化的失衡，而氧化應激導致中性粒細胞浸潤及T細胞活化，加重炎癥反應，造成內皮細胞嚴重受損，使機體代償調控機制發生紊亂，引起母體免疫損傷，導致膽堿能抗炎通路受損，使膽堿能系統出現異常，α7nAChR表達減少甚至丟失，失去對NF-κB信號通路的抑制作用，使NF-κB表達增多，釋放大量的毒性因子如炎性介質，使血管出現嚴重狹窄及重鑄障礙。

目前，治療子癇前期的唯一有效方式是終止妊娠。經證實，采用電刺激迷走神經和激活a7nAchR等方法激活膽堿能抗炎通路，對膿毒癥、缺血再灌注損傷、呼吸機引起的急性肺損傷、結腸炎和類風濕性關節炎等疾病均有良好的保護作用。Liu Y等[19]研究發現尼古丁可通過激活CAP，抑制NF-κB等炎癥因子的產生，且該作用與α7nAChR通路有關，認為膽堿能受體激動劑，如尼古丁等可通過抑制NF-κB的表達從而預防子癇前期發生發展。根據本研究的結果展開對電刺激迷走神經和a7nAchR激動劑的進一步研究，可能對子癇前期的發病機制以及防治提供新思路。