線粒體功能異常與卵巢衰老關系的研究進展

楊慧 孫若蕓 馬瑞紅 夏天 高慧

線粒體是顆粒細胞內含量最豐富的細胞器，卵母細胞線粒體是卵母細胞質中含量最為豐富的細胞器，若線粒體功能下降可能會影響卵母細胞質量，進而導致卵母細胞的老化，甚至卵巢衰老[1]。目前研究認為，卵巢衰老的分子生物學機制主要包括 DNA損傷修復[2]、端粒縮短[3]、代謝紊亂和線粒體功能異常。本文對線粒體與卵巢衰老相關文獻進行綜述，以了解線粒體與卵巢衰老之間的關系，為臨床上提高卵巢衰老有關的不孕癥治療的妊娠率提供理論依據。

一、線粒體功能

在真核細胞中，線粒體是唯一含有DNA的細胞器。電鏡顯示線粒體由內外雙層膜封閉環繞成桿形或顆粒形，內膜向線粒體基質皺褶形成嵴。基質中存在參與三羧酸循環的酶類，并且含有Ca2+、Mg2+等離子。線粒體DNA(mitochondrial DNA,mt DNA)多存在線粒體嵴上，并呈雙鏈環狀致密結構，基因組全序列長度為16.6 kb，共編碼37種基因，每個線粒體內有2～10個mt DNA 拷貝數。卵母細胞內含有2種基因組，即核DNA(nuclear DNA,n DNA)和mt DNA，而線粒體功能需要的大部分蛋白質由核基因編碼，由n DNA和mt DNA共同調控完成[4]。卵母細胞中線粒體及mt DNA是最多的。線粒體在機體內不僅作為能量工廠為細胞供能，為細胞活動提供幾乎全部的能量來源，還具有維持細胞內的鈣離子的穩態、參與細胞凋亡過程、合成嘧啶和血紅素等重要的生理功能。故目前認為，線粒體主要有以下4個功能：(1)產生ATP；(2)產生活性氧(reactive oxygen species，ROS)；(3)參與細胞凋亡途徑；(4)維持鈣離子平衡。

二、線粒體與卵巢衰老

1.線粒體數量與卵巢衰老

年齡是影響卵母細胞質量的重要原因之一[5]。而細胞內線粒體的數量會隨著年齡的增長而發生變化。女性隨著年齡的增長，機體的抗氧化能力逐漸降低，細胞內的氧自由基減少，ROS堆積，卵母細胞線粒體長期暴露在ROS堆積的環境中，線粒體出現基因突變、功能異常的可能性會增加，進而直接影響到卵母細胞的質量[6]。Simsek-Duran[7]等通過透射電子顯微鏡觀察不同年齡階段老鼠卵母細胞線粒體后發現，和年輕的老鼠相比，老齡鼠卵母細胞中的線粒體的數量明顯減少，最終導致卵母細胞質量的下降。

2.mt DNA與卵巢衰老

線粒體擁有自己獨立的遺傳物質—mt DNA，是獨立于n DNA之外、通過母系遺傳的一組遺傳物質。mt DNA拷貝數減少及mt DNA突變率增加導致線粒體功能異常，進而影響卵母細胞的質量以及胚胎發育狀況。

在細胞中，mt DNA編碼呼吸鏈上13種蛋白，其中包括復合體Ⅰ中7個亞基、復合體Ⅲ中1個亞基、復合體Ⅳ中3個亞基、復合體Ⅴ也就是ATP合酶的2個亞基。聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)技術可檢測人成熟卵子中mt DNA含量約為20 000～800 000個拷貝數不等[8]。而mt DNA拷貝數對卵母細胞的受精和早期胚胎發育有重要影響，可用來評價胚胎的質量[9]。mt DNA拷貝數下降，可影響線粒體呼吸鏈上13種蛋白質亞基的轉錄及翻譯，導致線粒體供能異常，影響受精卵和胚胎發育的質量。與n DNA相比，mt DNA沒有組蛋白的保護，而是被核基因編碼的線粒體轉錄因子A(mitochondrial transcription factor A，TFAM或mTFA)蛋白包裹著，無有效的修復系統，處于高自由基環境中，故mt DNA更容易遭受氧化應激，導致其結構突變，表達發生改變，引起呼吸鏈功能障礙，ATP減少，進一步增加mt DNA突變率及ROS產生進入惡性循環中。有文獻報道，mt DNA突變率和死亡率是nDNA的20倍左右[10]。當其受到不可修復的氧化應激時，線粒體呼吸鏈會被中斷，線粒體的膜電位平衡被打破，線粒體氧化磷酸化(oxidative phosphorylation,OXPHOS) 能力降低，合成三磷酸腺苷(adenosine trisphosphate,ATP)的能力減弱，最終導致卵母細胞的受精率和胚胎發育能力降低[11]。Santos[12]等通過研究發現，受精的卵子中mt DNA拷貝數比退化的卵子中的數量要高許多，也就是說，可以通過檢測卵母細胞中的mt DNA的拷貝數來評價卵母細胞的質量。

另外也有研究證實[13]，隨著女性年齡的增加，卵母細胞中的mt DNA的突變率和缺失率會顯著增高。Hsieh[14]等指出，隨著女性年齡增長，卵母細胞中mt DNA拷貝數減少、轉錄水平降低，女性卵母細胞的發育潛能降低。目前為止，研究人員已經找出了超過150種不同的mt DNA突變方式，其中最常出現的是Δmt DNA 4977片段缺失，該片段重排突變現象成為衰老的一個重要標志[15]。

3.ROS與卵巢衰老

正常情況下，機體內促氧化劑水平與抗氧化劑水平處在一種動態平衡之中。適量的ROS能夠維持細胞的生理功能，不僅參與調節細胞能量代謝、信號轉導、啟動有絲分裂及防御病原體等，而且還參與卵泡發育、卵母細胞成熟、排卵、黃體功能及卵泡閉鎖等過程[16]。若ROS產生過量或細胞抗氧化機制受損時，超出機體清除ROS的最大負荷量，體內ROS過量累積會引發細胞氧化應激(oxidative stress,OS)反應，破壞細胞的結構，最終可能導致DNA損傷、8-羥基脫氧鳥苷 (8-hydroxy-desoxyguanosine,8-OHdG) 的形成[17]，引起細胞的衰老及凋亡。褪黑色素(melatonin,MT)及其代謝產物可直接作為自由基清除劑，參與調控卵泡的生長發育、促進卵母細胞成熟和改善黃體功能，降低 ROS 產生并抑制 8-OHdG 形成，從而保護DNA 免受于氧化應激的損傷[18]。

顆粒細胞在活動過程中產生的抗氧化酶是清除ROS的主要因素，但隨年齡的增長，卵母細胞中抗氧化物酶的活性逐漸降低，進而影響卵母細胞質量。有研究顯示，在飲食和基因突變誘發的肥胖模型中，卵母細胞的氧化應激標記物(如ROS等) m RNA表達水平顯著升高及抗氧化標記物(如GSH-Px、SOD和CAT等)明顯減少[19]，誘導氧化應激，從而改變卵母細胞線粒體的分布，降低卵母細胞減數分裂成熟，破壞紡錘體形態并減少卵母細胞極性，最終導致卵母細胞質量下降。有文獻證實[20]，ROS與抗氧化劑之間的平衡能夠對卵母細胞的發育產生重大的影響，隨著女性年齡的增大，機體的抗氧化能力降低，二者之間的平衡被打破，因此機體內會累積過多的ROS，損壞線粒體的功能，容易攻擊線粒體膜，破壞其氧化磷酸化，使線粒體產生ATP的能力降低，線粒體基質中鈣離子的儲存降低，細胞質中的鈣離子水平增加。然而細胞質內的鈣離子濃度增加可引起細胞功能的紊亂，通過激活線粒體凋亡通路導致細胞減數分裂周期停滯和細胞凋亡[21]。另外，ROS抑制鈉鈣交換體活性和鈣離子信號分子鈣調蛋白活性，使內質網鈣離子儲存減少、細胞質內鈣離子增加，從而使鈣離子穩態出現異常[22]，降低卵母細胞質量，導致卵母細胞凋亡。

三、線粒體替代療法改善卵母細胞質量

卵母細胞數量減少及卵母細胞質量下降共同作用可導致卵巢衰老，隨著年齡的增長女性卵母細胞數量呈遞減趨勢，故可改善卵母細胞質量而延緩卵巢衰老。而在卵母細胞中，線粒體的含量最多，它不僅作為能量工廠提供能量ATP，并且還維持鈣離子的穩態等生理功能，起著重要作用，是卵巢衰老的決定性因素[23]。因此理論上可以通過改善線粒體功能或增加線粒體數量[24]來實現提高卵母細胞質量的目的。

近年來，越來越多的不孕患者通過輔助生殖技術得以受孕。對高齡不孕患者以及反復治療失敗的不孕患者，學者們嘗試利用線粒體替代療法這一新的生殖工程技術來改善卵母細胞質量提高助孕率[25]。線粒體替代療法即體外分離供體細胞的線粒體，通過顯微注射植入MⅡ卵細胞，進而促進卵細胞成熟并提高受精發育能力，其中包括原核移植、線粒體移植或胞漿移植、紡錘體移植和極體移植等，并取得了一定療效[26]。目前線粒體移植取得很大的進展且具有一定的前景。2015年初，英國首先批準了線粒體移植技術用以治療不孕[27]。異體線粒體移植有異質性問題及倫理問題，故線粒體移植必須取自自身細胞并且含有高質量、沒有基因缺失或突變的線粒體[28]。Tzeng等[29]在2001年首次報道，應用患者自體卵丘顆粒細胞線粒體移植至卵母細胞進行輔助生殖并且成功實現了3例臨床妊娠。在自體線粒體移植過程中卵巢干細胞(ovarianstem cells,OSC)為自體線粒體的優選。因顆粒細胞與卵細胞緊挨著，對卵細胞成熟發育的整個過程發揮著重要作用，因此，顆粒細胞的線粒體與卵細胞線粒體結構及作用大致相似，為最佳的供體。

因此，自體生殖系干細胞線粒體移植(autologous germline mitochondrial energy transfer,AUGMENT)為改善卵細胞質量提供了新的方向[30]。它通過ICSI將來源于OSC的線粒體與精子一起注射到卵母細胞中,最大限度地避免異質化風險并改善卵母細胞質量。線粒體的替代療法在操作的安全性及倫理性仍有爭議，故在臨床上還未被廣泛應用，需要進一步研究印證其有效性及安全性[31]。

四、展望

綜上所述,線粒體是卵巢衰老的決定因素，線粒體的功能與卵母細胞質量密切相關。目前有很多研究已顯示線粒體的功能對卵母細胞的質量有重要的影響，但其中的影響機制有待進一步的研究。近年來，隨著“二胎”政策的開放，越來越多的高齡女性進入備孕，為深入了解線粒體與卵母細胞衰老的關系并探索改善卵母細胞質量的方法。通過改善線粒體質量的手段提高卵子質量和妊娠率，提供更優化的助孕策略，將具有重要意義。