骨髓間充質干細胞復合關節軟骨脫細胞基質修復兔關節軟骨部分缺損的實驗研究

張志勇 于光屹 陶丹丹 高 巖 李 健 方世宇*

（大連大學附屬新華醫院骨科，遼寧 大連 116021）

關節軟骨中軟骨細胞較少，缺乏血供和神經營養，其修復能力有限。關節軟骨一旦損傷，即使是很小的面積，關節退變就不可避免。關節軟骨缺損分為軟骨全層缺損和軟骨部分缺損。組織工程學的發展提供了一種組織再生的技術手段。選擇合適來源的種子細胞和支架材料是組織工程修復中常用的研究方法。骨髓間充質干細胞（BMSCs）復合關節軟骨脫細胞基質可修復全層軟骨缺損，生成透明軟骨樣組織[1]。本研究用骨髓間充質干細胞（BMSCs）復合關節軟骨脫細胞基質修復兔關節軟骨部分缺損。

1 材料與方法

1.1 實驗動物：選取36只3～4個月齡的健康新西蘭兔，各體質量約3.0 kg，購買自大連醫科大學動物實驗中心。

1.2 實驗試劑及儀器：胰蛋白酶粉劑、DNase粉劑，RNase粉劑，胎牛血清、二氧化碳培養箱，FD-1冷凍干燥機。

1.3 BMSCs的分離與體外培養：采用密度梯度離心法分離BMSCs，并進行體外培養[2]。

1.4 脫細胞關節軟骨基質的制備：通過冷凍干燥、化學去污劑等方法制備關節軟骨脫細胞基質[3]。

1.5 兔關節軟骨部分缺損模型制備：選取36只新西蘭兔，在兔雙側股骨踝關節面用直徑為5 mm的鉆孔儀鉆1～1.5 mm深的孔，以不出血為標準。

1.6 實驗分組和修復方法：將36只關節軟骨部分缺損模型的新西蘭兔隨機分成3組，每組各12只，每組24個膝關節樣本，分別進行3種不同的處理：A組將BMSCs與關節軟骨脫細胞基質復合物修復軟骨缺損；

B組單純用脫細胞軟骨基質修復缺損；C組為軟骨部分缺損處不做任何處理。各組在術后4、8、12周分別處死4只新西蘭兔，取雙側膝關節組織，進行大體觀察，并通過HE染色對比觀察缺損部位的修復情況。

1.7 統計學分析：參照Wakitani 評分量表對各實驗結果進行評分，并利用SPSS 13.0分析各實驗組間是否存在顯著性差異。數值均以平均值±標準差（±s）表示，統計學分析采用t檢驗，P＜0.05表示具有顯著性差異。

2 結 果

2.1 實驗用兔統計：在本研究中將36只新西蘭兔隨機分為3組，每組12只，實驗過程中無意外死亡，全部計入結果分析。

2.2 體外分離及培養骨髓間充質干細胞：密度梯度離心法分離培養兔骨髓間充質干細胞，并利用流式細胞儀分析細胞表面抗原分子，發現BMSCs特異性高表達抗原CD44，而不表達層粘連蛋白和CD34。

2.3 脫細胞關節軟骨基質的制備及其特性：Massion染色結果可見關節軟骨脫細胞基質中存在很多的軟骨陷窩且其周圍存在大量的膠原纖維。

2.4 大體觀察和組織學觀察：術后4周，A組軟骨缺損基本修復，B、C組還可見凹陷，與周圍軟骨界限模糊；A組修復組織呈黃色，顏色偏淡，HE染色見少量類似幼稚軟骨細胞，細胞排列不規則，周圍未見典型的陷窩樣結構，有較少的基質。B、C組見缺損區表面的凹陷，被覆纖維組織；術后8周，B組基本完全修復，C組還見小凹陷。A組缺損處修復組織較前增多，顏色呈淡黃色，表面較4周時光滑，有一定彈性，與周圍正常軟骨分界未消失。A組修復組織中可見類幼稚軟骨細胞數量增多，類軟骨陷窩出現，分布不均勻。B、C組缺損區為纖維組織覆蓋，呈波紋狀走行，修復組織異染，少而不均勻；12周時C組凹陷消失。A組缺損區修復組織色澤，質地同正常關節軟骨，HE染色見類軟骨細胞，其形態接近正常軟骨細胞，但排列非柱狀，類軟骨陷窩增多。B、C組缺損區基本為纖維組織覆蓋，深灰白色，質軟，與周圍正常軟骨組織分界清楚。兩組修復組織多為原纖維，呈波紋狀排列，未見軟骨陷窩形成。

2.5 組織學評分：各時間點各組動物利用Wakitani 評分進行組織學評分，A組各時間點的評分均優于B、C組，且差異有統計學意義（P＜0.05）；B、C組各對應時間點相比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。A組在不同時間點兩兩比較也有統計學差異（P＜0.05），見表1。

表1 各組各時間點組織切片Wakitani評分（±s）

表1 各組各時間點組織切片Wakitani評分（±s）

組別 時間(周) 關節數(個) 細胞形態 基質染色 表面平整 軟骨厚度 與周圍結合 總分A組 4 8 1.2±0.3 1.3±0.4 1.2±0.2 1.0±0.1 1.2±0.1 6.0±1.0 8 8 0.8±0.1 0.6±0.3 0.5±0.2 0.6±0.0 0.5±0.2 3.1±0.8 12 8 0.2±0.3 0.2±0.4 0.3±0.3 0.3±0.3 0.3±0.3 1.3±1.6 B組 4 8 2.2±0.4 2.0±0.3 2.1±0.4 1.5±0.1 1.2±0.1 9.0±1.2 8 8 1.8±0.1 1.8±0.3 1.5±0.3 1.4±0.0 1.0±0.2 6.1±0.8 12 8 1.2±0.2 1.5±0.5 1.1±0.4 1.3±0.3 0.9±0.5 4.2±1.9 C組 4 8 3.2±0.5 2.8±0.4 2.8±0.5 2.0±0.1 2.2±0.1 13±1.0 8 8 2.8±0.1 2.6±0.3 2.5±0.3 1.8±0.0 1.8±0.2 11.8±0.8 12 8 2.2±0.3 2,2±0.5 2.3±0.5 1.6±0.3 1.5±0.5 9.8±1.9

3 討 論

關節軟骨缺損是臨床常見疾病之一。軟骨的修復一直是研究的熱點。組織工程的發展提供了一種新的修復方法。骨髓間充質干細胞有較強的低免疫原性和較低的抗原呈遞能力，可作為種子細胞廣泛應用于同種異體移植。脫細胞組織基質有良好的組織相容性，細胞吸附性以及親水性，并最大程度模擬細胞生長的外環境，可作為組織工程中的支架材料[4]。關節軟骨缺損分為軟骨全層缺損和軟骨部分缺損。關節軟骨部分缺損未穿破軟骨下骨，髓腔內的血管不會影響軟骨損傷區，這不同于軟骨全層缺損。

本研究中應用骨髓間充質干細胞（BMSCs）復合關節軟骨脫細胞基質修復兔關節軟骨部分缺損，結果顯示可以生產軟骨樣組織修復缺損部位。而單獨應用脫細胞軟骨基質修復缺損部位生成的為纖維組織。表明骨髓間充質干細胞在體內可被誘導分化為軟骨細胞。相信在不久的將來，隨著關節軟骨損傷修復研究日益深入，組織工程技術將為關節軟骨損傷修復提供重要手段。