畢赤酵母菌bFGF轉化株的篩選及鑒定

國微，楊新朝，閆堯，姜銳

（北華大學理學院，吉林吉林 132013；吉林省中藥生物技術創新中心，吉林吉林 132013）

堿性成纖維細胞生長因子（Basic fibroblast growth factor，以下簡稱bFGF）是細胞生長和分化的重要調節因子，具有促血管生成、細胞增殖、細胞趨化、細胞遷移等活性，能促進愈合傷口產生膠原蛋白、纖維連接蛋白和基質酶的基質成分、抑制瘢痕形成,作為皮膚組織中的受體結合分子，bFGF啟動皮膚細胞的生長、分裂和分化、恢復細胞的活性的作用，使bFGF的應用開始從臨床進入護膚美容領域，并顯示其對美容駐顏的巨大潛力，而被稱為“二十一世紀的化妝品”，在皮膚美容方面具有十分廣闊的開發利用前景。巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）是目前研究和應用較多的外源蛋白表達系統[1]，到目前為止已有400多個外源蛋白得到成功表達，是目前分子生物學領域中用于表達重組蛋白的標準工具之一，也是具有前景的商業蛋白生產工具之一[2-3]。由于畢赤酵母表達系統的卓越性和bFGF的強大的生物功能，本實驗室構建了畢赤酵母bFGF轉化株，但菌種插入的bFGF基因是否能夠得以表達，且表達量是否存在差異，本研究對轉化株進行bFGF基因表達篩選及鑒定，并篩選出表達量較高的菌株作為菌種為后續大規模發酵奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

吉林省中藥生物技術創新中心實驗室構建的畢赤酵母菌bFGF轉化株His+型，-80 ℃冰箱凍存菌種。

1.2 主要試劑及藥品

RD液體培養基、RDB瓊脂平板、RD頂層瓊脂、MD平板、MM平板、YPD培養基、BMGY培養基、BMMY培養基、試劑盒：Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Kit For Fibroblast Growth Factor2，Basic(FGF2)，Cloud-Cline Corp。

1.3 儀器

搖床（興科THZ82A）、天平(HANGPING JY2002型)、立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安LDZX型）、恒溫培養箱（博訊DNP-9002BS型）。

1.4 實驗方法

1.4.1 畢赤酵母重組菌的Mut+Muts表型篩選[11]

取2010年凍存于-80 ℃冰箱的畢赤酵母菌bFGF轉化株甘油凍存菌，編號9D和X各1管，解凍取100 μL，加入到10 mL融化的RD液體培養基中，輕搖震蕩混勻，傾倒于RDB瓊脂平板上，靜置凝固后將平板倒置于28 ℃恒溫培養箱內培養3 d，頂層瓊脂中有大量轉化株出現。于超凈臺內用無菌涂布器刮取頂層瓊脂，放入到50 mL無菌離心管中，加入20 mL無菌去離子水制成懸浮液，通過漩渦震蕩使菌從瓊脂中分離出來。用4層無菌紗布過濾去除瓊脂，剩余濾液用8000rpm離心5分鐘，菌體沉淀在離心管底部，小心剝離上層的瓊脂，輕輕將上清倒掉，加入5 mL無菌去離子水重懸菌體。蘸取重懸液在MD平板上劃線，倒置于30 ℃恒溫培養箱內培養。2 d后用牙簽挑取單克隆，同時在MD和MM平板的同一位置接種，30 ℃恒溫培養箱倒置培養。

1.3.2 bFGF轉化株測序及比對

36 h后，選取即在MM又在MD培養基上生長的單克隆接種入10mlYPD培養基中，分別編號9d1～9d6、x1～x5，置于搖床200 r/min，28 ℃，約24 h菌液OD600＞2時停止培養，取5 mL培養液離心棄上清，沉淀送上海生工生物工程有限公司測序。

測序結果通過Blast進行序列比對，確定目的基因是否為bFGF。

1.3.3 轉化株bFGF表達量篩選

取確定為bFGF轉化株的YPD培養液200 μL加入到20 mL BMGY培養基中擴大培養，其余加入15%甘油后分裝凍存。BMGY培養約24 h后停止，8000rpm離心5分鐘，棄上清，加入BMMY培養基重懸菌體至OD600=1.0，取20 mL為一瓶，置于搖床28 ℃，200 r/min震蕩培養，添加甲醇保持甲醇終濃度0.5%。4 d后，8000rpm離心10 min，取上清液凍干、稱重。試劑盒測定各菌株bFGF表達量。

2 結果與分析

2.1 Mut+Muts 表型篩選結果

Mut+為甲醇利用型，既在MD培養基上生長，又在MM培養基上生長，Muts為甲醇緩慢生長型，只在MD培養基上生長。實驗結果（圖1）顯示從編號9D、X的畢赤酵母重組菌中挑取的共99個單克隆均為Mut+型。

圖1 單克隆表型篩選結果

2.2 測序及比對

菌樣送上海生工生物工程有限公司檢測。使用通用引物對菌體基因組進行擴增，結果如表1所示。9d1、9d2、9d3、9d6、x2、x3、x4、x5均含有插入片段，對插入片段PCR產物進一步測序，測序結果通過BLAST進行序列比對，顯示插入的目的片段與人FGF2基因序列系列相似度為100%，即以上菌株確定為bFGF轉化株。且11個單克隆中有8個檢出目的基因，確定畢赤酵母菌bFGF轉化株可表達bFGF基因。

2.3 轉化株表達bFGF能力篩選

使用試劑盒對不同轉化株單克隆發酵液的bFGF表達量進行測定，結果如表2所示。其中，9d3表達量最高，凍干粉中bFGF含量為0.27 ng/g，發酵液表達量為13.14 ng/L。因此，適宜選取9d3作為后續大規模發酵的菌種。

表1 PCR及序列比對結果

圖2 9d3的PCR產物序列與bFGF基因序列比對情況

表2 不同單克隆bFGF表達量情況

圖3 不同單克隆bFGF表達量情況

3 討論

重組質粒在酵母菌中的穩定存在是決定外源基因高效穩定表達的前提[1]。盡管重組畢赤酵母菌表達菌株較其他工程菌而言遺傳穩定性較高，但是也會出現較少的遺傳丟失現象，同時子代個體間也會出現一定的差異性[8]。基因工程菌的遺傳穩定性直接影響重組蛋白的表達，分離純化，乃至后期的產業化生產[9]，為了獲得高表達的轉化株，本實驗對構建的bFGF轉化株進行篩選及鑒定，實驗結果顯示重組畢赤酵母菌中挑取的共99個單克隆均為Mut+型，表型穩定；且11個單克隆中有8個檢出目的基因，說明轉化株穩定性較高；對8個檢出目的基因的單克隆進行bFGF表達能力篩選，表達能力各有不同，其中9d3表達量最高，發酵液表達量為13.14 ng/L。因此，適宜選取9d3作為后續大規模發酵的菌種。本研究對重組畢赤酵母菌進行了鑒定，并篩選出高表達菌株為后續大規模發酵提供菌種。