白花延齡草水提液對四氯化碳致小鼠肝纖維化的保護作用

王益富 ，姜 瑋 ，劉 媛

（1.同濟大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院藥學(xué)部，上海 200072； 2.江蘇省泰州市食品藥品檢驗所，江蘇 泰州 225300；3.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇 蘇州 215006）

當(dāng)肝臟細胞外基質(zhì)（ECM）的合成大于降解時，其在肝臟內(nèi)會慢慢沉積，最終導(dǎo)致肝纖維化［1］。肝纖維化是慢性肝病的一個重要病理特征，也是肝硬化發(fā)生的重要環(huán)節(jié)，是慢性的病理過程。肝臟細胞外基質(zhì)的主要形成細胞是肝星狀細胞［2］。多種細胞因子與肝星狀細胞的激活密切相關(guān)，目前已知肝星狀細胞的最強絲裂原是血小板衍生生長因子。肝星狀細胞是導(dǎo)致肝臟纖維化的主要細胞之一，在外界因素的刺激下如轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）、肝星狀細胞轉(zhuǎn)化為纖維細胞，進一步產(chǎn)生大量的細胞外基質(zhì)蛋白，最終發(fā)生肝纖維化，通過抑制TGF-β對肝纖維化具有改善作用［3-6］。白花延齡草Trillium kamtschaticumPall.ex Pursh為百合科延齡草屬植物，用于治療高血壓、失眠等疾病［7-10］。本研究中探討白花延齡草水提液抗肝纖維化作用及其可能的作用機制。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動物

儀器：FLUOstar Omega型全自動多功能酶標儀（德國 BMG Labtech公司）；Mini V-GES型垂直電泳槽（美國Wealtec公司）；LIOO JS-500型生物顯微鏡（北京京昊永成商貿(mào)有限公司）；Milli-Q Gradient A10型超純水儀（美國Merck Millipore公司）；分析天平（天津市天馬儀器廠）；TGL-16C型高速離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

試藥：白花延齡草藥材（批號為20170605）購自安徽亳州，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院巢建國教授鑒定為白花延齡草Trillium camschatcenseKer Gawl.exPursh的干燥根莖，實驗時加一定量蒸餾水煎煮，濃縮為1 g／mL的液體，冷藏，備用；扶正化瘀膠囊（上海黃海制藥有限責(zé)任公司，批號為151040）；橄欖油（西班牙犀牛特級初榨橄欖油）；CCl4（分析純，上海中試化工總公司，批號為20100030），臨用前溶于橄欖油配成20%濃度的油液；天門冬酸氨基轉(zhuǎn)氨酶（AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所。

動物：SPF 級 C57小鼠 50只，雄性，體質(zhì)量（20±2）g，7周齡，購自南京市青龍山動物繁殖中心，動物合格證號為SZ（蘇）20150002。飼養(yǎng)條件為房間溫度24℃，相對濕度45% ～55%，小鼠正常飲水、喂食。所有實驗均遵循南京中醫(yī)藥大學(xué)大學(xué)藥學(xué)院動物實驗規(guī)范和動物實驗倫理。

1.2 方法

肝纖維化模型建立及給藥：建立肝纖維化動物模型［11-14］。第 5 周開始，給予白花延齡草水提液 0.5 g ／kg（給藥 A組）和 1 g／kg（給藥 B組）及扶正化瘀膠囊（0.75 g ／kg，陽性對照組）進行干預(yù) 14 d，第 6 周實驗結(jié)束后，麻醉小鼠，取肝臟及血液，用于后續(xù)分析。

血清學(xué)肝功能測定：取上述血液適量，先37℃條件下保溫0.5 h，然后在4℃條件下靜置2 h，離心10 min（2 000 r／min），將離心后的血清在-80℃保存，用于肝功能指標的檢測。

肝臟組織SOD，MDA檢測：將肝組織用生理鹽水（1∶9）勻漿，根據(jù)試劑盒的說明，檢測SOD和MDA水平。

蘇木精 - 伊紅（HE）染色：參考文獻［11-14］，對肝組織進行固定，取材，乙醇梯度脫水，石蠟包埋切片，對小鼠肝組織作HE染色，觀察纖維化程度。

蛋白質(zhì)印跡（Western Blot）法：加裂解液收集肝臟組織裂解物總蛋白，組織蛋白行SDS-PAGE并轉(zhuǎn)印至PVDF膜，常溫下封閉2 h，與TGF-β一抗孵育，進一步進行二抗反應(yīng)，發(fā)光試劑顯影后用灰度成像軟件測定條帶的光密度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)以表示，用 Graphpad Prism 5.0統(tǒng)計軟件對多組比較行單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對血液AST及ALT的影響

與空白組相比，模型組血清中ALT和AST顯著增高（P＜0.01）；與模型組相比，給藥組肝臟血清中AST和ALT水平顯著降低（P＜0.01）。詳見圖1。

圖1 白花延齡草水提液對肝纖維化小鼠的肝功能生化指標的影響（X ± s，n=10）

2.2 對肝臟SOD及MDA的影響

與空白組相比，模型組小鼠肝臟中SOD顯著降低，MDA顯著增高（P＜0.01）；與模型組相比，給藥組小鼠肝臟中SOD顯著增高，MDA顯著降低（P＜0.01）。詳見圖2。

2.3 肝臟病理損傷

空白組小鼠肝臟肝細胞均表現(xiàn)正常，肝細胞索排列較整齊，未見脂肪變性和纖維結(jié)締組織增生，未見水樣變性，未見形成假小葉，且枯否氏細胞也未見增生。毛細血管與匯管區(qū)內(nèi)膽管均未見有膽汁淤積，匯管區(qū)未見纖維組織增生，未見炎性細胞浸潤。模型組小鼠肝臟均可見炎性細胞浸潤、肝細胞水樣變性、壞死和脂肪變性。提示給藥組能顯著改善上述病理改變，結(jié)果見圖3。

圖2 白花延齡草水提液對肝纖維化小鼠肝臟SOD，MDA的影響（X ± s，n=10）

2.4 對TGF-β蛋白表達的影響

與空白組相比，模型組小鼠肝臟TGF-β蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比，給藥組小鼠肝臟TGF-β蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01）。詳見圖4和圖5。

3 討論

醫(yī)學(xué)檢測的肝纖維化程度正是肝損傷的主要指標之一。肝纖維化屬可逆性病變，由于肝纖維化模型簡單、成功率高、死亡率低，故本試驗選擇通過注射CCl4造模。

脂質(zhì)過氧化反應(yīng)在肝纖維化形成過程中起重要作用，而SOD對機體的氧化與抗氧化平衡具有重要作用，MDA可反映過氧化反應(yīng)的程度。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，白花延齡草水提液可明顯降低MDA的量，提高SOD活性，提示白花延齡草水提液具有較強的抗氧化能力，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)是其抗肝纖維化的機制。

圖3 白花延齡草水提液作用于肝纖維化小鼠的病理學(xué)變化（×200）

圖4 白花延齡草水提液對TGF-β蛋白表達（蛋白電泳）的影響

圖5 白花延齡草水提液對TGF-β蛋白表達的影響（X ± s，n=10）

肝纖維化大多是慢性肝損傷后，肝臟內(nèi)以膠原為主的胞外基質(zhì)過度沉積導(dǎo)致的。肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)主要是肝臟損傷-肝實質(zhì)炎癥、壞死-肝星狀細胞，激活-大量細胞外基質(zhì)沉積。TGF-β不僅可激活肝星狀細胞，還可促進合成膠原，而肝星狀細胞又是胞外基質(zhì)的主要來源［15］，從而可能導(dǎo)致肝纖維化。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，白花延齡草水提液可顯著降低TGF-β蛋白表達水平，是其抗肝纖維化的機制之一。

ALT和AST是肝臟病變程度的重要指標，廣泛存在于肝臟細胞的細胞質(zhì)中，肝臟病變或發(fā)炎時ALT和AST就會從肝細胞釋放到血液中，顯著提高ALT和AST水平。本研究結(jié)果顯示，白花延齡草水提液能顯著降低ALT和AST水平，對病癥或炎性細胞組織有明顯改善作用，是其抗肝纖維化的機制之一。

肝纖維化在中醫(yī)理論上屬氣滯血瘀之病變［16］，白花延齡草具有祛風(fēng)、舒肝、活血、止血功效，臨床多用于肝病、高血壓等病癥。白花延齡草含有多種甾體皂苷和氨基酸類成分，故課題組選擇以水為溶劑，加熱回流提取濃縮后給藥。本研究結(jié)果表明，白花延齡草水提液治療肝纖維化療效顯著，可能與其所含活性成分密切相關(guān)，其中薯蕷皂苷元具有較強的抗炎功效，賴氨酸能促進新陳代謝，提高肝細胞活性。目前，關(guān)于白花延齡草相關(guān)藥理活性研究較少，以后的研究中應(yīng)加強活性成分的藥理作用研究。