低氧高碳酸環境對大鼠肺炎模型中左氧氟沙星分布的影響*

李 琪 ，匡 扶 ，劉春漪 ，許 瑞 ，周向東 △

（1.海南醫學院第一附屬醫院，海南 ?？?570102； 2.重慶醫科大學附屬第二醫院，重慶 400010）

大腸埃希菌是常見革蘭陰性菌肺炎致病菌，近年來的感染率明顯增加，在醫院內獲得性肺炎中的比例增加尤為明顯，是腸內營養、機械通氣、慢性阻塞性肺疾?。–OPD）等患者發生肺部感染的主要致病菌［1-2］。左氧氟沙星（LVFX）作為呼吸喹諾酮類的代表性藥物，以其在抗菌譜、安全性、經濟性、有效性等多方面的綜合良好表現，成為目前呼吸科廣泛運用的喹諾酮類抗菌藥物［3-4］。而機體微環境改變也可能影響藥物抗菌效應的發揮，如pH對喹諾酮類藥物介導的殺傷有明顯影響［5］。在對奇異變形桿菌的殺菌效應研究中，pH為5和9時，環丙沙星的殺菌率下降，而pH為7時殺菌時間最短［6］。鹽酸左氧氟沙星在酸性條件下的抗菌活性降低，隨著血清濃度及細菌接種量的提高，鹽酸左氧氟沙星的最低抑菌濃度（MIC）值增大 2 ～4 倍［7］。左氧氟沙星對幽門螺桿菌體外抗菌活性的研究結果顯示，pH為4～5時的抗菌活性明顯低于pH為7時［8］。在慢性氣道炎癥如COPD合并感染的情況下，氣道微環境常常發生變化，尤其是發生低氧高碳酸血癥時，機體、氣道局部pH的改變是否會影響喹諾酮類如左氧氟沙星的抗菌效應，目前國內外尚未見報道。本研究中通過建立低氧高碳酸血癥大鼠肺炎模型，考察了低氧高碳酸環境下左氧氟沙星在血液、支氣管肺組織及支氣管肺泡灌洗液（BALF）中的分布及濃度情況，為臨床合理應用左氧氟沙星提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動物

儀器：Agilentl 100型高效液相色譜儀系統（美國Agilent公司，包括泵系統，可調波長紫外檢測器，Agilent 1100型工作站）；SK-1型快速混勻器（江蘇中大儀器廠）；B160A型醫用低速離心機（河北省安新縣自洋離心機廠）；GF.1型高速分散器（江蘇其林醫用儀器廠）；BP61型電子天平（德國Sartorius公司）。

試藥：鹽酸左氧氟沙星氯化鈉注射液（江蘇揚子江藥業集團有限公司，批號為15041131，規格為每瓶0.3 g∶100 mL）；環丙沙星（中國食品藥品檢定研究院，批號為130451-201203）；甲醇、二氯甲烷均為色譜純，其他試劑均為分析純。大腸埃希菌標準菌株（ATCC25922，由重慶醫科大學附屬第二醫院細菌室提供）。

動物：健康合格SD大鼠112只，SPF級，體質量為180～200 g，雌雄各半，由重慶醫科大學實驗動物中心提供（實驗動物使用許可證號為SCXK＜渝＞2012-0001）。所有動物實驗遵照海南醫學院生物醫學倫理委員會動物實驗倫理委員會規定（科倫審第＜2014＞126號）。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱：AmethystC18-H 柱（150mm ×4.6mm，5μm，120A）；預柱：Dikma EasyGuard ⅡSilica Kit柱（10 mm ×4 mm）；流動相：甲醇 -0.008 mol／L 磷酸鹽緩沖液 -0.5 mol／L 四丁基溴化銨（V／V／V，25 ∶75 ∶4）；流速：0.4 mL ／min；檢測波長：290 nm；柱溫：40 ℃ ；進樣量：40 μL；內標：環丙沙星。

1.2.2 模型建立

大鼠低氧高碳酸血癥模型：將大鼠置低氧高濃度CO2密封艙（10%O2，7% ～8%CO2，氮氣平衡），每天 7 h，連續4周；對照組為正常空氣環境下飼養。

單純肺炎模型：參考DEVANEY等［9］方法并作改進，將大腸埃希菌標準菌液調制成0.5麥氏濃度的菌液，每只大鼠給予0.2 mL菌懸液緩慢注入氣管，建立感染大腸埃希菌的大鼠肺炎模型。

低氧高碳酸血癥肺炎模型：在低氧高碳酸血癥建模成功的基礎上予以大腸埃希菌感染，方法同上。

給藥：感染24 h后，予左氧氟沙星干預，尾靜脈注射左氧氟沙星氯化鈉注射液50 mg／kg［10］。

1.2.3 標本采集

取大鼠 56 只，分別于給藥后 0.5，1，2，4，8，12，24 h時取全血，并按時間點分為7個小組，每組8只。以2 500 g（g為重力加速度）轉速離心5 min，取上層血漿；同時，將大鼠麻醉處死，取肺支氣管組織，并用2 mL生理鹽水反復沖洗支氣管，收集BALF；肺組織和支氣管組織稱定質量后分別制成勻漿，將勻漿與BALF分別以2 500 g（g為重力加速度）轉速離心 5 min，取上清液，置-20℃ 冰箱冷藏。

1.2.4 樣品處理

取大鼠血漿 100 μL，加入 33.62 μg ／mL 的內標環丙沙星20 μL，或取肺組織／支氣管組織上清液500 μL，BALF 上清層 1 mL，各加入 33.62 μg／mL 的內標環丙沙星10 μL，渦旋10 s混勻，加入4 mL二氯甲烷，渦旋混勻1 min，以3 000 g（g為重力加速度）轉速離心5 min，靜置分層，小心吸取上清液，置40℃水浴中，氮氣吹干。以 100 μL流動相復溶，40 μL進樣分析。

1.3 統計學處理

采用Kinetica 4.4軟件計算藥代動力學參數，采用SPSS 13.0統計軟件進行分析。計量資料以均數±標準差（X±s）表示，行配對t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 樣品色譜行為

按擬訂色譜條件測定，血漿、支氣管肺組織、BALF中左氧氟沙星、內標環丙沙星的保留時間分別為5 min和8 min，二者峰形良好，未受血漿、組織內源性物質干擾，色譜圖見圖1。

2.2 方法學考察

圖1 高效液相色譜圖

標準曲線、線性關系考察與最低定量濃度確定：在空白血漿、支氣管肺組織勻漿和BALF中加入左氧氟沙星標準品，分別配制成不同質量濃度：0.015，0.306，0.612，1.225，2.450，4.900，9.800，19.600mg／L；0.039，0.078，0.156，0.312，0.625，1.250，2.500，5.000 mg ／L；0.015，0.030，0.060，0.090，0.120，0.240，0.360，0.480 mg ／L。同 1.2.4 項下方法處理樣品，每個樣品測定5次。計算左氧氟沙星峰面積與內標環丙沙星峰面積之比（As／Ai），以As／Ai（Y）對左氧氟沙星質量濃度（X）進行線性回歸，所得空白血漿、支氣管肺組織勻漿和BALF中左氧氟沙星的標準曲線分別為：Y1=1.7038X1+0.043 3（r=0.999 8），Y2=2.503 6X2-0.048 4（r=0.999 9），Y3=8.515 7X3+0.124 4（r=0.999 6）。線性范圍分別為 0.015 ～9.800 mg／L，0.039 ～5.000 mg／L，0.015～0.480 mg／L，RSD均小于 10% （n=5）；最低定量濃度分別為 15，39，15 μg ／L（n=5），符合生物樣本的測定要求。

精密度、提取回收率與內標回收率試驗：用空白樣本加入左氧氟沙星配制3種不同質量濃度，同1.2.4項下方法處理樣品，每個質量濃度的樣本各5份，考察日內精密度（每個質量濃度1 d內測定5次）和日間精密度（每個濃度連續測5 d，每天測1次）。測得日內精密度、日間精密度的RSD均小于10%（n=5）。按測定量與加入量之比計算相對回收率，結果見表1。

表1 日內及日間精密度、提取回收率、內標回收率

穩定性試驗：樣品配制濃度同2.2項下“精密度與相對回收率”，冷凍穩定性考察參數：反復冷凍（-20℃）、融化（60℃左右）3次；溫度因素考察參數：4℃ 、室溫22℃左右、60℃；時間因素考察參數：室溫分別放置2，4，8 h后處理。結果顯示，在以上條件下各濃度樣品測定值的RSD均小于10%（n=3），表明左氧氟沙星在各組織中的穩定性良好。詳見表2。

表2 穩定性試驗結果（X ± s，n=3）

2.3 建模結果

結果見表3，可見低氧高碳酸血癥模型造模成功。

表3 各組大鼠動脈血氣指標比較（X ± s，n=8）

2.4 大鼠血液、支氣管肺組織和BALF中藥物濃度

各組大鼠按50 mg／kg靜脈注射鹽酸左氧氟沙星注射液后，測定各時間點的血藥濃度。結果見表4。

2.5 藥代動力學參數

將血漿、支氣管肺組織和BALF中所測左氧氟沙星濃度、時間數據經Kinetica 4.4軟件分析均符合二室模型。低氧高碳酸血癥環境下的單純肺炎組中，血漿、支氣管肺組織及BALF中的AUC0-24與單純肺炎組相比，均明顯下降，差異有統計學意義（P＜0.05）；支氣管肺組織、BALF中清除率也有所增加（P＜0.05）。詳見表5。

表4 各組大鼠靜脈注射左氧氟沙星后各指標比較（X ± s，n=8）

表5 各組大鼠靜脈注射左氧氟沙星主要藥代動力學參數（X ± s，n=8）

3 討論

左氧氟沙星在肺組織中穿透力強，尤其是肺泡巨噬細胞、支氣管黏膜及分泌物中濃度較高，安全性和耐受性良好［11］，抗菌譜覆蓋了呼吸道主要致病菌，對革蘭陽性菌和陰性菌均有廣譜抗菌活性，對支原體、衣原體、軍團菌和分支桿菌屬等也有較好活性，故治療呼吸道感染優勢明顯，被稱為“呼吸喹諾酮”。其對支原體、衣原體、軍團菌和分支桿菌屬等病原體比R（+）-氧氟沙星的活性更顯著［12］，但不同氣道微環境對左氧氟沙星的抗菌效能有何影響至今鮮有報道。COPD患者常合并低氧及高碳酸血癥，機體出現一系列復雜的病理生理改變，常出現藥物療效不佳的情況，可能與藥物的吸收及分布變化有關。

大腸埃希菌是引起革蘭陰性菌肺炎的僅次于肺炎克雷伯菌的第2位常見病原菌，由于人口老齡化、基礎疾病的增加、醫療管道的使用等因素，致其發生率呈逐年上升趨勢。COPD急性加重住院患者常合并肺部感染，而大腸埃希菌感染的比例也較高，故本研究中選取大腸埃希菌建立肺炎模型。本研究結果顯示，在低氧高碳酸血癥肺炎組中，左氧氟沙星在血液、支氣管肺組織、BALF中的濃度較單純肺炎組明顯降低，尤其在支氣管肺組織中變化尤為明顯，AUC0-24降低，而藥物在肺組織中的半衰期縮短，清除率增加，表明在低氧高碳酸血癥環境下，機體對左氧氟沙星的吸收和生物利用度降低。肺組織局部血藥濃度降低也可能與低氧環境下肺動脈收縮、肺血流減少致藥物分布減少有關。有研究顯示，在酸性環境中，左氧氟沙星離子反應增強，光降解率增加［13］；在低氧狀態下，體內羥自由基生成增多，這也會促進左氧氟沙星的降解［14］，提示在低氧高碳酸環境中，左氧氟沙星的降解會有不同程度的增加，這也是致血藥濃度降低的原因之一。

在治療重癥加強護理病房機械通氣相關性肺炎的病例中，左氧氟沙星在12 h間隔給藥情況下，其血液AUC0-24低于健康受試者30% ～40%，可能與藥物的清除率增加，導致t1／2β清除半衰期縮短有關［15］。本研究結果發現，在低氧高碳酸組，左氧氟沙星在血液、支氣管肺組織、BALF中的濃度及AUC0-24普遍下降，表明在低氧高碳酸血癥環境下，機體對左氧氟沙星利用率的普遍下降可能與低氧高碳酸環境下機體發生的一系列復雜病理生理改變有關，這與臨床情況相符，如慢性呼吸衰竭患者常出現腎功能不全，致腎血管痙攣、腎血流減少，一定程度地影響了血液中藥物清除率。

綜上所述，慢性呼吸衰竭合并肺部感染是臨床治療中的一大難題，患者常因治療反應不理想而延長住院時間，進一步增加了感染尤其是耐藥菌感染的概率。臨床治療中應積極糾正該類患者機體的低氧高碳酸血癥狀態，或尋求最利于藥物分布和吸收的治療方案，從而減少抗菌藥物的使用種類及劑量，更合理地運用抗菌藥物，減輕患者負擔，降低細菌耐藥率。