菊三七致肝損傷及其毒性機制的研究進展Δ

李云鶴，茍小軍，王夏雷，詹美榕，李修龍，賈益群#（.上海中醫(yī)藥大學科技實驗中心分析測試室，上海003；.上海市寶山區(qū)中西醫(yī)結合醫(yī)院中心實驗室，上海 0900）

隨著中醫(yī)藥現(xiàn)代化與國際化的迅速發(fā)展，中藥及其制劑在全球醫(yī)療和保健中的應用都愈發(fā)廣泛[1]。而近年來，中藥安全性問題卻日漸突顯。由于我國地袤物博，各地區(qū)自然環(huán)境與人物環(huán)境差異巨大，加之中草藥的種類復雜繁多，導致存在因地域差別而帶來的同名異物現(xiàn)象較普遍[2]，真?zhèn)位煜⑼e用帶來的嚴重后果如造成患者肝損傷甚至中毒致死[3]，應引起高度重視。

三七和景天三七作為心腦血管疾病的常用中藥，均具有活血化瘀、止血止痛的功效，在臨床上應用廣泛[4-5]。菊三七為菊科菊三七屬植物菊葉三七[Gynura segetum（Lour.）Merr.]的根或全草，又名“紅背三七”“狗頭三七”，有破血散瘀、消腫止血之功效，始載于《滇南本草》。景天三七（Sedum aizonL.）為景天科景天屬多年生草本植物，又名“費菜”，是我國歷史悠久的藥食兩用植物[6]。菊三七因含有吡咯里西啶類生物堿（PAs），可引起肝小靜脈損傷，導致肝竇阻塞綜合征（HSOS）[7]。而具有毒性的菊三七因與三七、景天三七有相似的功效，加之菊三七與景天三七在民間又都被稱作“土三七”，因此菊三七容易被誤食而引發(fā)肝血竇等肝損傷病癥，后果嚴重[8]。筆者以“菊三七”“毒性機制”“肝損傷”“肝竇阻塞綜合征”“Gynura segetum”“Toxicity mechanism”“Liver damage”“HSOS”等為關鍵詞，在中國知網(wǎng)、萬方數(shù)據(jù)、PubMed等數(shù)據(jù)庫中組合查詢2000年1月－2019年1月發(fā)表的中英文相關文獻。結果，共檢索到文獻70 922篇，最終納入有效文獻42篇。現(xiàn)對菊三七致肝損傷的發(fā)展及其毒性機制進行綜述,旨在為深入研究菊三七的毒性機制提供依據(jù)，同時為臨床尋求有效的治療方法提供思路。

1 菊三七與HSOS

HSOS，又被稱為肝小靜脈閉塞癥（Hepatic veno-occlusivedisease，HVOD），是以肝竇內(nèi)皮細胞毒性損傷引起的肝腫大、腹水和高膽紅素血癥為特征的一種肝功能異常和門靜脈高壓的肝臟血管性疾病[9-10]。臨床癥狀主要以腹水、腹脹、腹痛、黃疸、肝腫大、肝區(qū)疼痛等為特征表現(xiàn)，實驗室檢查以肝功能損害為主，血清生化指標上以丙氨酸轉氨酶（ALT）、天冬氨酸轉氨酶（AST）、總膽紅素（TBIL）、直接膽紅素（DBIL）升高和白蛋白（ALB）降低為主，病理上是以肝小靜脈壁增厚、肝纖維化、管腔狹窄，繼而發(fā)生肝細胞萎縮、彌散性肝纖維化和肝硬化門脈高壓為主要特征[11]。在西方國家，HSOS被認為是一種常見的與大劑量化療、放療和骨髓造血干細胞移植（HSCT）有關的并發(fā)癥[12-13]。而在國內(nèi)，多數(shù)HSOS患者則是因服用含PAs的中草藥所致[14]。我國學者侯景貴[15]在1980年首次報道了關于服用菊三七致HVOD的2例臨床病例，引起了人們的關注。近年來，國內(nèi)因服用菊三七而引發(fā)的中毒報道日益增多，已逐漸引起臨床重視[16-18]。中華醫(yī)學會消化病學分會肝膽疾病協(xié)作組的報告曾指出，我國以PAs導致HSOS的患者中，因誤食菊三七而導致HSOS的患者約占50.0%～88.6%[19]。由此可見，菊三七因含有PAs，其所致的HSOS應引起臨床高度重視。

2 菊三七主要毒性成分的分離鑒定及菊三七致肝損傷動物模型的建立

菊三七主要含有生物堿類、黃酮類、色原酮類、香豆素類、酚酸類、萜類、甾醇類等多種結構類型的化合物[20]。其中，PAs為菊三七的主要肝毒性成分[21]，可引起肝細胞出血性壞死并引發(fā)HSOS[22]。早在1990年，我國研究者袁珊琴等[23]就已開始對菊三七中的生物堿進行研究，分離并鑒定了包括已知的千里光堿（Senecionine）、千里光菲靈堿（Seneciphylline），和未知的新成分菊三七堿甲（Sineciphyllinine）、菊三七堿乙[（E）-sineciphylline]在內(nèi)的4個生物堿。直至2006年，高新生等[24]從菊三七根部中提取并鑒定了超過5種以上的有毒性的PAs成分，其中包括具有強肝毒性的千里光堿、全緣千里光堿和千里光菲靈堿；同時，該研究初步建立了菊三七致小鼠HSOS模型。

為了更深入地研究其發(fā)病機制，2011年，宋宇等[25]給大鼠灌胃不同濃度的菊三七水煎劑，結果發(fā)現(xiàn)灌胃的給藥濃度、劑量以及大鼠的性別均直接影響著造模的成功率；結合給藥后的大鼠肝臟病理切片變化，該研究最終使用雄性SD大鼠成功建立了HSOS模型。茍小軍等[26]也通過實驗證明菊三七水煎劑灌胃法能夠成功復制HSOS模型，且在病理機制上與人類HSOS相似。

3 菊三七致肝損傷的發(fā)病機制

菊三七誘發(fā)肝功能衰竭的毒性機制尚不明確，目前研究者普遍認為菊三七致肝毒性是與其所含的PAs經(jīng)肝代謝后生成的毒性成分有關系；此外，細胞分子水平的相關研究也表明，不飽和型PAs可使細胞器受損、內(nèi)皮細胞損傷、細胞凋亡等，進而產(chǎn)生較強的肝細胞毒性；近年來興起的代謝組學的相關研究也從機體整體角度出發(fā)證明了PAs可通過介導膽汁酸代謝、氨基酸代謝等代謝異常致肝損傷的毒性機制。

3.1 毒性代謝物相關研究

3.1.1 PAs毒性代謝物 PAs的結構是由千里光次酸和千里光次堿兩種基本成分構成，屬于雙環(huán)氨基醇衍生物，可分為飽和型和不飽和型。飽和型無明顯毒性或低毒性，而不飽和型具有極強的肝毒性[27]。不飽和型PAs進入肝臟后，可通過細胞色素P450酶（CYP）3A的催化發(fā)生氧化和去甲基化反應，生成活性中間代謝物脫氫吡咯烷生物堿（DHPAs），再經(jīng)水解后生成脫氫裂堿（DHR）。DHPAs和DHR可以與蛋白結合形成吡咯蛋白加合物（PPAs），進而損傷肝竇內(nèi)皮細胞[28]，這可能是PAs誘導HSOS的主要原因。Yang M等[28]以人肝竇內(nèi)皮細胞（HSEC）和人肝癌細胞HepG2這兩種缺乏CYP酶活性的細胞為對象，測定了DHPAs和DHR的直接細胞毒性，證明了活性代謝物可介導PAs中毒，并在研究中揭示了DHPAs和DHR（尤其是DHPAs）為導致PAs誘發(fā)肝損傷的重要反應代謝物。該研究還對DHPAs和DHR的毒性強弱進行了直接比較，發(fā)現(xiàn)DHPAs具有比DHR更高的毒性效力，因此DHPAs被證明是主要引起PAs中毒的主要致病代謝物[29]。Chojkier M等[27]還發(fā)現(xiàn)CYP3A的誘導劑和抑制劑可分別加速和阻斷PAs的代謝，通常CYP3A誘導劑會增強PAs的毒性，而CYP3A抑制劑則會減弱PAs的毒性。

由此可見，不飽和型PAs、PAs毒性代謝物及CYP3A酶在菊三七誘發(fā)肝損傷的發(fā)生和發(fā)展中具有重要的作用。

3.1.2 PA氮-氧化物代謝物的激活 在多種植物中，PAs與PA氮-氧化物是共存的，Yang MB等[29]在研究中確定了PA氮-氧化物可在人體內(nèi)誘發(fā)HSOS，也證實了PA氮-氧化物在嚙齒類動物體內(nèi)的肝毒性。該研究還利用嚙齒類動物模型確定了由PAs代謝激活形成的PPAs是由PA氮-氧化物代謝產(chǎn)生的，其中PPAs可引起肝毒性，但PA氮-氧化物誘導的肝毒性一般遠低于其相應的PAs。雖然PA氮-氧化物代謝物一般無活性，可通過尿液排出，但過量的代謝物可進一步轉化為有毒的環(huán)氧化合物，損害細胞功能[30]。

3.2 細胞分子學相關研究

對于菊三七致肝毒性的前期研究大多集中于PAs的代謝毒性，近年來，隨著細胞分子生物學的發(fā)展，研究方向開始轉向了細胞毒性層面，并發(fā)現(xiàn)在菊三七致肝損傷發(fā)生與發(fā)展的整個過程中，不僅代謝物起了關鍵作用，體內(nèi)細胞毒性的作用也不可忽視。

3.2.1 PAs的細胞毒性 有研究表明，不飽和型PAs的環(huán)1，2位雙鍵上能形成烯丙醇酯結構，此結構通過與肝細胞中DNA、RNA、酶和蛋白質等親核基團的結合而發(fā)生烴化反應，進而使肝細胞的細胞膜、線粒體、內(nèi)質網(wǎng)等細胞器受損而產(chǎn)生功能性障礙，最終表現(xiàn)出較強的肝細胞毒性[31]。

3.2.2 PAs誘導的肝損傷與谷胱甘肽（GSH）的減少有關 細胞內(nèi)的GSH一般以還原形式存在，在氧化應激過程中可轉化為氧化形式。GSH是一種重要的細胞內(nèi)抗氧化劑，其能與有毒物質結合，參與致癌物質、自由基和過氧化物的解毒過程，從而最終保護細胞和器官免受氧化應激誘導的毒性損傷。而PAs和PA氮-氧化物會消耗體內(nèi)的GSH，這使得肝小葉第三區(qū)域的肝竇內(nèi)皮細胞更容易受損[28]。有研究表明，肝腺泡第三區(qū)的肝細胞含有豐富的CYP酶，因此PAs所致HSOS主要集中于肝腺泡分區(qū)的第三區(qū)，該區(qū)中具有解毒作用的GSH含量較少，且肝竇內(nèi)皮細胞中的GSH更少，故PAs在氧化應激后更容易造成肝竇及內(nèi)皮細胞損傷[32]。Chen Y等[33]的體外研究也表明，細胞內(nèi)GSH在調(diào)節(jié)PAs誘導的細胞毒性中起重要作用。Yang MB等[29]的體外研究同樣表明，PAs誘導的HSOS與血竇內(nèi)皮細胞中GSH的消耗有關，這表明PAs誘導的氧化應激反應能促進肝竇內(nèi)皮細胞損傷，進而造成肝損傷。

3.2.3 PAs誘導的細胞凋亡 Liu W等[34]的體外研究結果顯示，PAs能抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡，且呈劑量依賴性。上述作用的機制之一是其可降低抗凋亡蛋白Bcl-xL的表達和提高促凋亡蛋白Bax的表達，其中Bax可促進細胞色素C從線粒體中釋放從而促進細胞凋亡。另一種觀點則認為，PAs誘導細胞凋亡的機制是通過降低抗凋亡蛋白Bcl-xL或p53的表達和增加促凋亡蛋白Bax的表達，以達到抑制肝細胞增殖的目的，從而實現(xiàn)PAs誘導細胞凋亡[28]。Zuckerman M等[35]進行的體外研究發(fā)現(xiàn)，PAs在高濃度下可導致細胞壞死，在較低濃度下還會加快細胞凋亡，促使β微管蛋白破壞以及核染色體異常。進一步研究發(fā)現(xiàn)，PAs能刺激單核細胞分泌腫瘤壞死因子α（TNF-α）、內(nèi)皮素1（ET-1）和白細胞介素1β（IL-1β）等細胞因子。其中，TNF-α能誘導正常的內(nèi)皮細胞發(fā)生凋亡，TNF-α、IL-1β則可維持血液高凝狀態(tài)[31]。這表明細胞凋亡在HSOS的發(fā)生、發(fā)展中也具有重要作用。

3.2.4 細胞外基質（ECM）降解 ECM起著維持細胞正常結構和生理功能的作用，基質金屬蛋白酶（MMPs）能夠降解大部分ECM成分。當MMPs異常增長時，ECM則被過度降解，進而促使原本正常的細胞表型和功能被破壞[36]。Yu XZ等[37]通過建立HSOS大鼠模型發(fā)現(xiàn)在菊三七致HSOS的早期，肝竇內(nèi)皮細胞損傷與MMPs表達增加有相關性，MMPs表達增多會使ECM降解增多，從而破壞肝竇內(nèi)皮細胞的連續(xù)性。因此，在菊三七致HSOS的初期病理階段，發(fā)生肝竇內(nèi)皮細胞結構的不連續(xù)性有可能與該區(qū)肝竇細胞內(nèi)高表達的MMPs有關，從而最終導致細胞功能和表型的破壞。

3.3 代謝組學相關研究

代謝組學的研究可以揭示生物體在受到藥物干擾后自身內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的變化引起的內(nèi)在毒性機制[38]，從而從整體角度來評價菊三七致肝損傷的機制。房蓮相[39]對小鼠HSOS模型及臨床HSOS患者進行血清代謝圖譜分析，結果發(fā)現(xiàn)，菊三七致肝損傷與其膽汁酸的腸肝循環(huán)遭到破壞、進而使膽汁酸代謝紊亂有關。仇守蓓[40]應用超高效液相-質譜法對不同時間點、不同給藥劑量下的菊三七灌胃大鼠的血清、尿液和肝組織代謝物進行代謝輪廓分析，并對給藥組與空白組的內(nèi)源性代謝物進行多元統(tǒng)計學分析，在得到差異代謝物的基礎上進一步鑒定篩選出16個潛在標志物，以及12條代謝通路，該研究最終表明菊三七致肝損傷機制可能與氨基酸代謝、脂肪代謝及能量代謝等紊亂有關，從而揭示了菊三七的毒性機制。林珠燦等[41]采用超高效液相-四極桿飛行時間質譜法建立了空白組與菊三七總生物堿給藥組大鼠的血清代謝指紋圖譜，并利用多元統(tǒng)計分析比較了兩組間代謝物的圖譜差異，篩選鑒定出34個可作為肝毒性潛在生物標記物的差異代謝物，該研究表明菊三七總生物堿致肝損傷可能與氨基酸代謝、核苷酸代謝及脂質代謝等途徑的異常有關，最終從代謝組學的角度初步探索了菊三七總生物堿致肝損傷的作用機制。詹美榕等[42]在基于液相色譜-串聯(lián)質譜技術的基礎上，檢測給予菊三七后大鼠尿液內(nèi)源性代謝物的變化，并進行多元統(tǒng)計分析，篩選并鑒定出40個差異代謝物，7條主要代謝通路，該研究表明菊三七誘導大鼠肝損傷的機制可能與苯丙氨酸代謝、煙酸代謝、煙酰胺代謝及維生素B2代謝有關。

代謝組學方面的研究表明，菊三七進入機體后使內(nèi)源性代謝物發(fā)生明顯的差異變化，導致體內(nèi)氨基酸、膽汁酸等代謝紊亂，進而導致肝毒性。這點與前期大量研究中的觀點“PAs激活體內(nèi)毒性代謝物進而引發(fā)肝損傷”的結論相照應。

4 結論

由于中藥對機體的調(diào)控作用是整體性的，因此對于中藥引發(fā)的藥源性肝損傷，也應從整體的角度出發(fā)進行研究，以符合中醫(yī)藥的“整體性”理論。而目前，對于菊三七致肝損傷的研究多集中于從毒性代謝物和細胞分子毒性的角度來研究，大多僅通過對某一兩個毒性成分或從某個單一角度采用多種分析方法進行中藥毒性作用及其機制的探究，而對于菊三七致肝損傷的系統(tǒng)性和整體性研究較少，不利于全面的闡明中藥菊三七對機體的影響。因此，今后研究者可應用系統(tǒng)生物學和生物信息科學等方法，采用系統(tǒng)的、綜合的研究思路和手段從整體水平上動態(tài)地對一個集合體系（組織、細胞或生物體）的特征、活動規(guī)律和相互聯(lián)系加以研究，這可能會是菊三七致肝損傷相關機制研究的一個突破口，從而有助于臨床醫(yī)務人員在了解其中毒機制的水平上尋求更有效的治療手段。