苜蓿蛋白抗氧化肽的研究

韓雅利，高丹丹，馬洪鑫，余 瓊，李明生

（西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅蘭州 700124）

生物活性肽是由2～20種氨基酸通過肽鍵連結而成一類化合物，具有抗氧化、免疫促進、激素調節(jié)、抗菌抗病毒，以及降血壓和降血脂等生理功能[1]。近年來，生物小分子以其分子量小、易吸收、活性高等特點越來越受到人們的青睞，其中抗氧化肽更成為研究的熱點之一[2]。目前，引起人類機體衰老的重要原因是氧化作用的這一觀點已被證實，而自由基則是引起氧化作用的關鍵因素。自由基極不穩(wěn)定，可與膜中的不飽和脂肪酸進行反應，生成過氧化產物，在一定的條件下，又可分解成更多的自由基，引起一系列的連鎖反應，從而導致細胞、線粒體、DNA等廣泛損傷[3]，造成衰老和惡性腫瘤等多種疾病。

苜蓿，是一種多年生豆科草本植物[4]，全國的種植面積已達130×104hm2，因其產量高、營養(yǎng)豐富、適口性好為人們所喜食，被譽為“牧草之王”[5]。目前，國內酶解植物蛋白制備抗氧化活性多肽的研究已經全面展開[6]。現(xiàn)已報道，抗氧化活性肽的植物蛋白源有大豆蛋白、小麥谷蛋白、玉米蛋白、碎米蛋白等，而苜蓿活性肽至今還未開發(fā)，國內外大部分苜蓿主要用于動物飼料，少量停留在對苜蓿蛋白提取及其營養(yǎng)成分分析上，其水解后的蛋白肽活性和功能機理卻未見研究。因此，對苜蓿活性肽類產品的研究與開發(fā)就具有十分重要的意義。試驗以苜蓿葉為原料，經過提取、水解蛋白后制得抗氧化肽，以多肽物對自由基的清除率、金屬離子的螯合率和其還原能力為指標，篩選出最佳抗氧化肽水解用酶，為苜蓿蛋白的高效利用和有效開發(fā)提供理論依據(jù)，提高苜蓿的生物附加值，促進西北地區(qū)的經濟發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苜蓿葉，甘肅省榆中縣西北民族大學生命科學與工程學院植物培育場提供；胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶，北京中生瑞泰科技有限公司提供；胰蛋白酶、DPPH自由基，Sigma公司產品；福林酚，深圳市康初源有限公司提供；三氯乙酸（TCA）、氯化亞鐵、過氧化氫（30%）、氫氧化鈉、鹽酸、鄰二氮菲、鄰苯三酚（沒食子酚）、菲咯嗪、鐵氫化鉀等試劑，蘭州銀河化工原料有限公司提供。

表1 5種不同蛋白酶酶解反應條件

1.2 儀器與設備

JA2003N型電子精密天平，上海菁海儀器有限公司產品；HI8424型便攜式防水型酸度計，上海東原儀器廠產品；冷凍干燥機；干燥箱；722E型可見光分光光度計；HWS26型電熱恒溫水浴鍋，河南兄弟儀器設備有限公司產品；H2050R型臺式高速冷凍離心機，湖南長沙湘儀離心機儀器有限公司產品；LGJ-10型真空冷凍干燥機，北京松原華興科技發(fā)展有限公司產品；JJ-2型組織搗碎機，金壇杰瑞爾儀器公司產品。

1.3 方法

1.3.1 二次加熱提取苜蓿蛋白

摘取苜蓿葉，將苜蓿葉清洗、烘干，放入組織攪碎機中打成粉末備用。在苜蓿粉中按照一定的料液比加入蒸餾水，放入50℃恒溫水浴鍋中水浴1 h，用紗布過濾后，濾液置于85℃恒溫水浴鍋中50 min，取出后，封裝于離心管中進行離心，棄去上清液，得到濕蛋白，再將其冷凍干燥，制得蛋白粉備用，放入-20℃條件下保存。

1.3.2 酶解液的制備

取5 g苜蓿蛋白粉，溶于100 mL水中，配成5%的溶液。在保持酶活力相等的情況下，將5份樣液中分別加入不同量的胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶，同時調節(jié)各個酶的最適pH值，并置于其最適溫度下進行水解。在酶解的過程中要不斷用1 mol/L氫氧化鈉或鹽酸進行調節(jié)，使得pH值的幅度為0.5之間，酶解4 h后，將混合液于90℃水浴加熱滅酶15 min，放置冷水下沖洗進行快速冷卻，冷卻后添加同量10%的三氯乙酸，充分混勻后，在常溫條件下以轉速10 000 r/min，離心15 min，沉降酶類物質、未酶解的苜蓿蛋白以及其他雜質，留取上清液，置于冷凍條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

5種不同蛋白酶酶解反應條件見表1。

1.3.3 苜蓿抗氧化肽活性測定

（1） DPPH·清除能力測定。取1 mL苜蓿蛋白水解液，按照相同體積加入0.2 mmol/L DPPH·溶液（95%無水乙醇為溶劑配制），然后加人2.0 mL的水混合均勻，避光處反應30 min后，于波長517 nm處測定其吸光度，每組做3個平行，以95%乙醇代替蛋白水解液和DPPH·溶液做空白試驗[7-10]。按以下公式計算DPPH·的清除率為：

式中：A0——95%乙醇代替樣品所測得的吸光度；

A1——酶解液的吸光度；

A2——95%乙醇代替DPPH·所測得的吸光度。

式中：A0——Tris-HCl代替酶解物所得吸光度；

A1——酶解液的吸光度。

（3） 羥自由基清除能力測定[14]。分別在裝有1 mL的蛋白水解液的5個試管中加入1.5 mL PBS緩沖液，再分別加入1.5 mL 1,10-菲啰啉（0.75 mmol/L） 和FeSO4溶液，搖勻，待其37℃恒溫水浴鍋中充分反應30 min后，將試液置于比色皿中，于波長536 nm處測定各管的OD值，為A1；以蒸餾水代替試液，再加入0.01%的H2O2，此溶液為A2；用相同體積的H2O代替H2O2溶液，其他條件不變，此溶液為A0。羥自由基（·OH）清除率的計算公式如下：

（4） 金屬離子螯合能力測定[15]。取酶解液1 mL于試管中，加入氯化亞鐵溶液0.1 mL、菲咯嗪溶液0.2 mL和水2.5 mL，搖勻，將樣液置于避光處充分反應10 min，于波長562 nm處測其OD值。調零管A0：水代替酶解液所測吸光度；A1管：水代替氯化亞鐵溶液。按如下計算Fe2+螯合率：

（5）還原能力測定。參考文獻[16]的方法并略作改動，1 mL酶解液中加入2.5 mL PBS緩沖液、2.5 mL 1%鐵氰化鉀，將其放入50℃恒溫水浴鍋中反應20 min后取出，使其冷卻，再分別加入10%TCA，混勻反應體系，以轉速5 000 r/min離心10 min，取上清液，在5支試管中分別添加0.1%三氯化鐵1 mL，水5 mL，于波長700 nm處測吸光度進行比較。

2 結果與分析

2.1 DPPH·清除能力分析

據(jù)研究報道，DPPH·溶于無水乙醇后，可形成紫色溶液，由于其組分顏色較深，具有最高吸光度，于波長517 nm處可測定。當DPPH·遇到抗氧化物質時，其分子結構中的未成對電子開始進行自由配對，形成黃色溶液，顏色變淺，吸光度降低，因此可利用吸光度的變化程度來判定多肽液的抗氧化能力[17]，吸光度越高，則證明試液對自由基的清除效果越好，抗氧化活性也就越高。

5種不同蛋白酶水解液DPPH·清除率的比較見圖1。

圖1 5種不同蛋白酶水解液DPPH·清除率的比較

由圖1可知，5種蛋白酶水解苜蓿蛋白所得的多肽液均對DPPH·有清除能力，其中胰蛋白酶水解物的清除率最好，明顯優(yōu)于其他蛋白酶水解物，為80.63%±1.65%，堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶水解物的清除率分別為67.90%±1.72%，70.30%±1.93%，67.71%±1.51%，胃蛋白酶水解物清除效果稍差，為60.20%±1.64%。

2.2 超氧陰離子自由基清除能力分析

超氧陰離子為造成人體損傷的一種主要自由基，主要來源于體系中黃嘌呤與黃嘌呤氧化酶的反應，以鄰苯三酚自氧化反應模擬體系產生，利用反應過程中形成的有色中間產物來判斷的清除能力。研究發(fā)現(xiàn)，該有色物質在波長325 nm有最大吸光度，加入蛋白多肽液后能夠抑制中間有色產物生成，使得該組分的吸光度降低。

圖2 5種不同蛋白酶酶解液清除率的比較

2.3 羥自由基（·OH）清除能力分析

羥自由基具有強氧化性，易對人體細胞造成損傷，使其生物結構發(fā)生變化。原理是反應系中的Fe2+能與1,10-菲啰啉結合形成紅色化合物，在可見光波長536 nm處有最高吸收值，而羥自由基可使體系中的Fe2+氧化成Fe3+，使吸光度降低，吸光度與羥自由基（·OH） 含量成正比，因此，可用吸光度來評價酶解物羥自由基（·OH） 的清除率。

5種不同蛋白酶酶解液對·OH清除率的比較見圖3。

圖3 5種不同蛋白酶酶解液對·OH清除率的比較

由圖3可知，5種蛋白酶水解物均有清除羥自由基（·OH）的能力，其中木瓜蛋白酶的清除作用最為顯著，達到37.60%±2.02%，胰蛋白酶水解物清除能力為22.30%±1.60%，胃蛋白酶、堿性蛋白酶以及中性蛋白酶的清除效果不佳，分別為14.90%±1.68%，16.15%±1.80%，17.40%±1.87%。

2.4 金屬離子（Fe2+）螯合能力分析

Fe2+為過渡金屬離子，可催化體內強氧化物質生成，造成人體生理功能紊亂。利用Fe2+作為自由基引發(fā)劑來評價金屬離子的螯合能力，F(xiàn)e2+遇到菲啰嗪會形成紅色復合體，其在波長562 nm處有強吸收，而受試物中的螯合劑，則會阻礙該復合體形成，使吸光度發(fā)生變化。

5種不同蛋白酶酶解液對Fe2+螯合率的比較見圖4。

由圖4可知，5種不同蛋白酶酶解苜蓿蛋白得到的物質對金屬離子（Fe2+）都有較好的螯合能力，其中尤其以木瓜蛋白酶酶解液最佳，為96.10%±2.06%，胰蛋白酶、胃蛋白酶、堿性蛋白酶和中性蛋白酶水解液的清除能力分別為95.10%±1.70%，84.60%±1.79%，93.47%±1.81%，94.50%±1.98%。

圖4 5種不同蛋白酶酶解液對Fe2+螯合率的比較

2.5 不同多肽液還原能力的分析

酶解液的還原能力可作為衡量其抗氧化性指標的原因是：還原能力強的物質通過為自由基提供電子配對形成穩(wěn)定的物質，來達到終止自由基反應的目的。試驗通過將反應液中的Fe3+還原成Fe2+，測定波長700 nm處的吸光度變化判斷其還原能力的強弱[18]，試液的還原能力越強，則表明其抗氧化性越好。

5種不同蛋白酶酶解液還原能力的比較見圖5。

圖5 5種不同蛋白酶酶解液還原能力的比較

由圖5可知，5種樣液均具有還原能力，由大到小依次為木瓜蛋白酶＞胰蛋白酶＞堿性蛋白酶＞中性蛋白酶＞胃蛋白酶。

3 結論

由于酶具有專一性的特點，不同的蛋白酶可能只對某些肽鍵或帶有某種基團的氨基酸作用，因此使用不同的蛋白酶酶解得到的多肽種類及其抗氧化性也存在差異[19]。經綜合分析，試驗中的木瓜蛋白酶和胰蛋白酶酶解苜蓿蛋白制得的抗氧化肽活性最好，具有較高的還原能力，并且對DPPH·、超氧陰離子（O2-·）、羥自由基（·OH） 的清除能力和螯合Fe2+的能力都要強于中性蛋白酶、堿性蛋白酶和胃蛋白酶的酶解產物，是酶解苜蓿蛋白的最優(yōu)酶，但是據(jù)相關研究報道，木瓜蛋白酶可降解植物細胞壁中的殼聚糖，而殼聚糖具有降血脂、降血糖的作用，且木瓜蛋白酶比胰蛋白酶可分解更多、更廣泛的蛋白底物，易造成多肽產品的不純凈、單一。因此，確定胰蛋白酶為苜?？寡趸嚯牡淖罴衙附庥妹?。