溶血對液相色譜串聯質譜檢測血漿中兒茶酚胺及其代謝產物的影響

袁鳳喜， 薛雄燕， 陳彩鳳， 賴月紅， 梁泳儀，李 巖， 謝雯春， 楊紹杰， 吳燕杰

（1.順德中科優聯醫學檢驗所，廣東 佛山 528000；2.佛山市第一人民醫院檢驗科，廣東 佛山 528000；3.中國科學院生物物理研究所，北京 100101）

嗜鉻細胞瘤和副神經節瘤（pheochromocytoma and paraganglioma，PPGL）是分別起源于腎上腺髓質的嗜鉻細胞和腎上腺外交感神經節細胞的腫瘤，嗜鉻細胞瘤占80%～85%，副神經節瘤占15%～20%，二者合稱為PPGL。PPGL會分泌大量的兒茶酚胺，包括腎上腺素（epinephrine，E）、去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）和多巴胺（dopamine，DA），造成患者的血壓陣發性或持續性升高。雖然PPGL患者只占普通高血壓患者的0.2%～0.6%，但這些患者如未能及時得到針對性治療，長期的高血壓可對患者的心、腦、腎等器官造成嚴重損傷，有些患者甚至會發生高血壓危象，危及生命。若PPGL患者能在早期得到準確、及時的診斷，通過手術切除腫瘤，高血壓可被治愈[1]。傳統的PPGL實驗室檢查是檢測血或尿中的E和NE水平。有研究結果顯示，E和NE的代謝產物變腎上腺素（metanephrine，MN）及去甲變腎上腺素（normetanephrine，NMN）主要在腎上腺髓質和PPGL瘤體內持續代謝產生，可以成為更好的PPGL檢測標志物[2-3]。2016年，中華醫學會內分泌分會發布的《嗜鉻細胞瘤和副神經節瘤診斷治療的專家共識》首推以血漿中游離的或尿中的MN、NMN水平來診斷PPGL，檢測血或尿中的E和NE水平也可對PPGL的診斷起輔助作用[4]。對于個別只分泌DA的PPGL可以檢測血漿或尿中的DA及其代謝產物3-甲氧基酪胺（3-methoxytyramine，3-MT）水平[5]。目前，臨床實驗室用于檢測MN和NMN水平的方法有酶聯免疫法、液相色譜串聯質譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LCMS/MS）、液相色譜電化學法，其中酶聯免疫法的敏感性相對較低[1，6]。《嗜鉻細胞瘤和副神經節瘤診斷治療的專家共識》也建議使用LCMS/MS或電化學法測定MN和NMN水平。電化學法易存在對目標峰的干擾，LC-MS/MS敏感性高、特異性好，因此越來越多地被用于小分子代謝產物的檢測。測定尿中的兒茶酚胺及其代謝產物時需要收集患者24 h尿，耗時長，患者不易配合，而收集血漿樣本的可操作性相對較強。因此，檢測血漿兒茶酚胺及其代謝產物的水平用于診斷PPGL會更簡便。溶血是血液樣本采集中最常遇到的問題，溶血樣本由于響應低、有基質效應等問題經常會影響LC-MS/MS的測定結果[7]。《中華人民共和國藥典：2015版》、歐洲藥品管理局、美國食品與藥品監督管理局都要求關注溶血樣本的基質效應[8-10]。為此，本研究擬探討溶血對LC-MS/MS測定兒茶酚胺及其代謝產物的影響，為臨床取樣提供參考。

1 材料和方法

1.1 樣本制備

1.1.1 溶血樣本制備 取肝素鋰抗凝血以4 470×g離心5 min，收集紅細胞，將紅細胞置于-80 ℃冰箱4 h后室溫融化，再以4 470×g離心10 min，取上清液，采用BC-5390CRP全自動血液細胞分析儀（深圳邁瑞公司）測定血紅蛋白（hemoglobin，Hb）水平，根據Hb水平用生理鹽水配成Hb分別為75.0、30.0、15.0和7.5 g/L的溶血液。分別取上述不同Hb水平的100 μL溶血液與無肉眼可見黃疸、脂濁或溶血的900 μL正常血漿混合，制備成溶血樣本。根據Hb水平將樣本的溶血程度分為：重度溶血（7.50 g/L）、中度溶血（3.00、1.50 g/L）和輕度溶血（0.75 g/L）；另取100 μL生理鹽水加入900 μL正常血漿中，作為無溶血的正常樣本。

1.1.2 含不同水平兒茶酚胺及其代謝產物的樣本制備 在一定體積的溶血樣本和正常樣本中分別加入3-MT、MN、NMN、DA、E、NE標準品混合溶液，制成低值和高值樣本。兒茶酚胺及其代謝產物加入血漿后的理論水平見表1。

表1 兒茶酚胺及其代謝產物加入血漿后的理論水平（pg/mL）

1.2 儀器與試劑

BC-5390CRP全自動血液細胞分析儀（深圳邁瑞公司）、TSQ Endura串聯質譜儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）、UltiMate3000高效液相色譜儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）。甲醇（LC-MS級）、乙腈（LC-MS級）購自美國Thermo Fisher Scientific公司，甲酸（LC-MS級）、異丙醇（分析純）、乙酸銨（LC-MS級）、甲酸銨（LC-MS級）及E、NE、DA、MN、NMN、3-MT標準品購自西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司，氘代內標E-d6、NE-d6、DA-d4、MN-d3、NMN-d3、3-MT-d4購自美國劍橋同位素實驗室。

1.3 方法

1.3.1 樣本前處理 （1）血漿樣本：取50 mmol/L醋酸銨250 μL、內標溶液（MN-d3、NMN-d3、3-MT-d4均為2 ng/mL，E-d6、NE-d6、DA-d4均為5 ng/mL）100 μL及高、低值樣本各200 μL，充分混勻后待用；（2）標準品溶液：取50 mmol/L醋酸銨250 μL、內標溶液（MN-d3、NMN-d3、3-MT-d4均為2 ng/mL，E-d6、NE-d6、DA-d4均為5 ng/mL）100 μL、兒茶酚胺（E、NE、DA均分別為156、312、625、1 250、2 500 pg/mL）或其代謝產物（MN、NMN、3-MT均分別為50、100、200、500、800 pg/mL）的標準品溶液200 μL，混勻待用。將Oasis弱陽離子交換96孔固相提取板（美國Waters公司）分別用200 μL甲醇和水進行預處理，將上述血漿或標準品樣本加入經預處理的各孔中，待樣本加載完成后，分別用20 mmol/L醋酸銨200 μL及乙腈與異丙醇的混合液（V∶V=50∶50）清洗樣本孔，最后用2份50 μL 85%乙腈水溶液（含2%甲酸）將目標化合物洗脫至接收板中。取10 μL洗脫液，采用LC-MS/MS檢測。每份樣本均重復3次前處理實驗。

1.3.2 色譜和質譜條件 （1）液相色譜條件：色譜柱為Xbridge BEH Amide色譜柱（2.5 μm，2.1 mm×100 mm，美國Waters 公司），柱溫為35 ℃，流動相A為100%含30 mmol/L甲酸銨、pH值3.0的水，流動相B為85%乙腈及15%含30 mmol/L甲酸銨、pH值3.0的水，流速為0.4 mL/min，梯度洗脫。（2）質譜條件：電噴霧離子源，正離子掃描，離子源噴霧電壓為3 600 V，離子傳輸管溫度為350 ℃，霧化溫度為330 ℃。

1.4 統計學方法

采用SPSS 17.0軟件進行統計分析。呈正態分布的計量數據以x±s表示，組間比較采用配對t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 標準曲線的建立

計算兒茶酚胺及其代謝產物標準品出峰面積與內標出峰面積的比值，將其與標準品溶液濃度作線性回歸。回歸方程見表1。通過標準曲線計算出溶血血漿以及正常血漿中3-MT、MN、NMN、DA、E、NE的水平。

表1 兒茶酚胺及其代謝產物標準曲線的回歸方程

2.2 不同溶血程度對高、低值3-MT、MN、NMN、DA、E、NE的影響

無論MN、NMN、3-MT是高值還是低值，除3-MT在Hb為7.50 g/L（重度溶血）時未能被檢測到外，其他不同溶血程度的樣本與正常樣本之間MN、NMN、3-MT的檢測結果差異均無統計學意義（P＞0.05）。高值3-MT、MN、NMN 3次檢測結果的變異系數（coefficient of variation，CV）均＜15%。低值3-MT在中度溶血（Hb為1.50 g/L）時、低值NMN在重度溶血（Hb為7.50 g/L）時3次檢測結果的CV均?＞15%，不符合《生物樣品定量分析方法驗證指導原則》[8]對精密度的要求。見表2～表5。

當DA、E、NE為低值時，輕度溶血（Hb為0.75 g/L）和Hb為1.50 g/L的中度溶血樣本的檢測結果與正常樣本比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。當DA、E、NE為高值時，輕度溶血樣本（Hb為0.75 g/L）和Hb為1.50 g/L的中度溶血樣本的DA、NE檢測結果與正常樣本比較差異均無統計學意義（P＞0.05），而E的檢測結果在Hb為1.50 g/L的中度溶血樣本中明顯降低（P＜0.05）。對于Hb為3.00 g/L的中度溶血樣本，無論DA、E、NE是高值還是低值均無法檢出。高、低值DA、E、NE在Hb≤1.50 g/L時3次檢測結果的CV均＜15%。見表2～表5。

表2 不同溶血程度樣本低值3-MT、MN、NMN、DA、E、NE的檢測結果 （x±s）

表3 不同溶血程度樣本低值3-MT、MN、NMN、DA、E、NE 3次檢測結果的CV （%）

表4 不同溶血程度樣本高值3-MT、MN、NMN、DA、E、NE的檢測結果 （x±s）

表5 不同溶血程度樣本高值3-MT、MN、NMN、DA、E、NE 3次檢測結果的CV （%）

3 討論

溶血樣本是臨床實驗室日常工作中最易遇到的問題樣本。造成樣本溶血的原因有很多：抽血時操作不當、對樣本的劇烈振蕩、突然冷凍等。溶血造成檢測結果異常的原因主要有：（1）血細胞破裂后，細胞內的成分如鉀、磷、酶類等進入血清或血漿，直接造成檢測結果異常；（2）Hb會對采用比色法的部分檢測項目存在干擾；（3）紅細胞釋放的過氧化物酶、腺苷酸激酶等對一些檢測項目存在干擾。本研究結果表明溶血對LC-MS/MS檢測兒茶酚胺及其代謝產物的最大影響在于待測物的質譜信號被強烈抑制，這可能有2個原因：（1）Hb對待測物有一定的吸附作用；（2）盡管對樣本進行前處理可去除血漿中的大分子，但在中度溶血和重度溶血的樣本中，Hb水平過高，可能已超出固相萃取板的處理能力，因此樣本中仍有大量Hb未被除去，進入質譜儀后，干擾了待測物的信號。另外，溶血對兒茶酚胺代謝產物的影響要遠遠小于對兒茶酚胺的影響，這可能與兒茶酚胺代謝產物比較穩定，質譜信號相對較強有關。總之，中度和重度溶血會對LC-MS/MS檢測兒茶酚胺及其代謝產物產生明顯影響。

有研究結果顯示，通過優化檢測方法、增強抗干擾能力、提升檢測敏感性，可消除溶血對LC-MS/MS檢測結果的影響。（1）溶血樣本中有干擾峰，可優化色譜條件，如流動相、色譜柱、洗脫梯度等，使待測物與基質分離[11]；HUGHES等[7]在檢測血漿中的阿托伐他汀時，通過優化流動相中有機相和水相的比例，消除溶血樣本中的干擾峰對內標物的影響。（2）溶血樣本中待測物信號受到抑制，一方面可優化樣本前處理過程，盡可能去除溶血產生的雜質，HUGHES等[7]通過在固相萃取處理前先進行蛋白沉淀，并在固相萃取處理時多進行一步酸洗，成功消除了溶血對卡維地洛定量分析的影響；另一方面也可優化離子源種類和質譜參數，提高敏感性；一般情況下，LC-MS/MS常用的離子源克服基質效應的能力依次為大氣壓光噴霧電離源、大氣壓化學電離源、電噴霧電離源[12]；（3）溶血樣本和非溶血樣本間的差異較大，可選用合適的內標。與結構類似物作為內標相比，同位素標記的內標可更加準確地修正基質效應對結果的影響，因此應盡可能使用穩定同位素標記的內標以消除基質效應的影響[7-8，13]。

綜上所述，由于肉眼不易判斷出溶血的程度，且樣本溶血程度的判斷標準尚未統一[14]，為了保證兒茶酚胺及其代謝產物檢測結果的準確性，在日常檢測的樣本采集過程中應盡量避免溶血，優化檢測方法可消除溶血對檢測結果的影響。