烏雞肽的營養成分及其功能特性研究

白芳，李映紅，黃飛娟，3，*，吳正治，*

（1.深圳大學附屬第一醫院，廣東深圳518035；2.深圳市老年醫學研究所，廣東深圳518020；3.中山大學附屬第一醫院，廣東廣州510080）

烏骨雞（Gallus gallus domesticus Brisson）是一種對氣虛、血虛、脾虛、腎虛、心虛等各類虛癥均有較好療效的藥用雞種，體內蛋白質和氨基酸含量豐富，營養價值極高[1-2]。研究表明，酶解烏骨雞肌肉獲得的蛋白酶解液（即為烏雞肽），多數為相對分子質量小于3 000 Da的小分子多肽類。這些小分子多肽的吸收機制優于游離氨基酸，并具有氨基酸不可比擬的生理功能和改善食品感官的效應[3-6]。主要表現為小分子多肽不需進行消化，可直接被人體吸收，其吸收具有主動性、完整性、載體功能等特點，并且具有抗衰老、抗氧化、提高免疫力、降血壓等一系列有助于人體健康的功效。

由于復合酶解法在制備多肽中應用普遍、酶解效果優越，且活性炭具有吸附脫色的作用，故本研究采用復合酶解法結合活性炭的吸附脫色作用制備烏雞肽[7-9]。烏雞肽制備完成后，本研究采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法檢測烏雞肽的總氨基酸、游離氨基酸含量及相對分子質量分布區間，并應用納升級液相色譜串聯質譜（Nano liquid chromatography tandem mass spectrometry，Nano LCMS/MS）技術對其組成成分及功能進行分析。該解析流程準確、可靠，不僅全面的解析了酶解活性炭吸附法制備烏雞肽的營養成分、制備效果及其潛在應用價值，同時也為其它小分子多肽的有效利用提供重要的分析技術參考。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

食品級木瓜蛋白酶（0.09 Au%）、風味蛋白酶（120 LAPu%）：中國廣州裕立寶科技有限公司；食品級活性炭：上海活性炭廠有限公司；乙腈（色譜級）、三氟乙酸（色譜級）、標準品（甘氨酸、乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸、抑肽酶）：美國sigma公司。

膠體磨：中國南通澳德精密機械公司；超濾膜（UEOS503，6 kDa）：中國天津膜天膜工程技術有限公司；島津LC20 AD高效液相色譜儀 [并配置日本島津凝膠色譜柱（TSK gel 2000 SWXL 300 mm×7.8 mm，5 μm）]：日本島津公司；液相色譜質譜聯用儀 [液相色譜儀（EASY-nLC 1000）、臺式高分辨質譜儀（LTQ Orbitrap Elite）]：美國Thermo Finnigan公司；液相色譜質譜聯用儀色譜柱（ReproSil Pur C18）：德國邁克公司。

1.2 烏雞肽制備

選取江西省泰和烏骨雞，體重1.5 kg左右，雌雄各半，復合酶解法制備烏骨雞活性肽[10-11]。烏骨雞肌肉蒸煮后，絞碎再加入膠體磨進一步磨碎，加入木瓜蛋白酶（0.09 Au%）和風味蛋白酶（120 LAPu%）進行水解，pH值為5.5，酶解溫度為55℃，酶解時間3.5 h。沸水高溫保持20 min進行滅酶，4 000 r/min離心15 min，分去上層油脂和下層沉淀物取中層液，活性炭粉末對中層溶液進行脫色處理，并使用相對分子質量為6 000 Da的濾膜進行超濾。

1.3 氨基酸組成測定

氨基酸組成分析采用2，4-二硝基氟苯柱前衍生法，操作步驟參照Liu等[3]的方法。總氨基酸檢測時，需要先將烏雞肽溶液中加入鹽酸溶液，110℃水解24 h處理；游離氨基酸檢測時，不需要進行鹽酸水解；其它參數參照文獻[3]的類似方法，570 nm波長處測定吸光度。

1.4 相對分子質量分布檢測

外標法分析多肽相對分子質量分布[12]。首先，應用高效液相色譜二極管陣列檢測器法（high performance liquid chromatography coupled pulsedamperometric de tection，HPLC-PAD）法分離烏雞肽溶液或標準品水溶液得到HPLC色譜圖。流動相采用0.1%三氟乙酸/乙腈/水體系，其中乙腈含量從15%至65%均勻上升梯度洗脫30 min，烏雞肽的進樣量10 μL，流速0.5 mL/min、柱溫30℃、進樣室溫度4℃、波長220 nm。其次，根據標準品測試結果繪制標準曲線，采用甘氨酸、乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸、抑肽酶4個標準品的保留時間（tR）對標準品相對分子質量的對數（lgMr）作圖。

1.5 Nano LC-MS/MS成分鑒定及分析

液相色譜-質譜聯用儀（Nano LC-MS/MS），其中液相為納升級、液相色譜柱為C18柱[13]。流動相為2%甲睛/0.1%甲酸/水體系，流動相梯度洗脫程序為：以0.1%甲酸含量變化為例，5%～15%、15 min，15%～90%、55 min，90%等梯度 20 min，流速為 0.1 mL/min，進樣量為10 μL。質譜條件為：EASY-Spray納流電噴霧離子源，毛細管電壓1.8 kV，毛細管溫度200℃。根據MS/MS圖譜中產生的正離子模式的碎片離子峰，用Proteome Discoverer軟件分析并通過UniProt全物種序列庫進行搜索。

2 結果分析

2.1 總氨基酸及游離氨基酸組

總氨基酸及游離氨基酸組成見表1。

烏骨雞復合酶解肽中，共發現17種氨基酸（表1）。總氨基酸含量為326.51 mg/g，游離氨基酸總含量為5.69 mg/g，游離氨基酸占總氨基酸的比例為1.74%。上述結果表明：烏雞肽的游離氨基酸含量偏低，多數組分應為肽類或蛋白質。總氨基酸含量較高者為Leu（57.01 mg/g）、Ala （55.83 mg/g）、His（54.85 mg/g）、Pro（48.05 mg/g）、Met（36.05 mg/g）和Phe（15.7 mg/g），游離氨基酸含量較高者為 Glu（1.09 mg/g）、Pro（0.64 mg/g）、Asp（0.64 mg/g）、Arg（0.60 mg/g）、Gly（0.55 mg/g）和 Ala（0.42 mg/g）。已有研究表明，Pro（48.05 mg/g）與多肽的抗氧化能力有關[10，14]，且 Leu、Met和 Phe（108.76 mg/g）均為必需氨基酸，這說明該烏雞肽營養成分豐富。

表1 總氨基酸及游離氨基酸組成Table 1 Total and free amino acid composition

2.2 相對分子質量分布范圍

相對分子質量分布區間見圖1。

標準曲線采用甘氨酸、乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸、抑肽酶等4個標準品的保留時間（tR）對標準品的相對分子質量對數（lgMr）作圖，線性方程為：y=-0.294 7x+8.338，R2=0.994 9。復合酶解活性炭吸附后烏雞肽的相對分子質量分布范圍為 0～6 918 Da，其中 6 918 Da～1 084 Da占 11.09%，1 084Da～279Da占 33.02%，279Da～124Da占27.90%，124Da～72Da占 8.56%（圖 1），主要集中在 0～1084Da，比例達到88.91%。上述結果說明：該烏雞肽含有較多利于人體吸收的小分子活性肽成分，且該復合酶解法對烏骨雞肌肉酶解充分、能用于烏骨雞小分子肽的制備。

2.3 Nano LC-MS/MS功能分析

烏雞肽的蛋白質來源見表2。

圖1 相對分子質量分布區間Fig.1 Molecular weight distribution range

表2 烏雞肽的蛋白質來源Table 2 Protein source of black-bone silky fowl peptide

續表2 烏雞肽的蛋白質來源Continue table 2 Protein source of black-bone silky fowl peptide

Nano LC-MS/MS共鑒定出源于2 287種肽段序列的107種蛋白質，其中種類最為豐富的蛋白為參與骨骼肌修復的蛋白及酶類。針對鑒定出來的蛋白得分大于30的前39種（表2）蛋白進行分析表明，該烏雞肽含有骨骼肌修復相關蛋白15種（比例為38.46%），這說明該烏雞肽很可能具有突出的強筋健骨功能。除此之外，在蛋白得分大于30的前39種蛋白中，還發現很多種類的其它功能蛋白，比如：參與組蛋白甲基化的組蛋白賴氨酸 N-甲基轉移酶 setd3（SETD3）[15]，在翻譯過程中不可或缺、參與損傷RNA降解的泛素-40S核糖體蛋白S27a（RS27A）[16]，促進癌細胞凋亡的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶 TAO3（TAOK3）[17]，參與細胞損傷、可能成為神經防護藥物作用靶點的紐蛋白（VINC）[18]。但是，膠原蛋白的發現是在得分14至30之間，推測可能是由于活性炭的吸附作用，造成了一些蛋白水解肽段的丟失，這也說明了以膠原蛋白肽為目的的研究開發，盡量避免使用活性炭進行脫色處理[9]。另外，Nano LC-MS/MS分析提供的鑒定蛋白的水解肽段信息也可以作為食品深度開發的參考。

3 結論和討論

烏雞多肽，是對生物機體的生命活動有益或具有生理作用的肽類化合物，其吸收機制優于游離氨基酸，且具有氨基酸不可比擬的生理功能和改善食品感官效應[2-5]。本研究對烏雞多肽的氨基酸組成進行分析后，采用外標HPLC法對其相對分子質量分布范圍進行分析，并且結合Nano LC-MS/MS技術進一步分析其成分特征。該研究全面的分析了酶解活性炭吸附法制備烏雞肽的成分，以此指導產品質量優化。

在復合酶解活性炭吸附法制備的烏雞肽中，游離氨基酸占總氨基酸的比例為1.74%，總氨基酸含量較高者為 Leu、Ala、His、Pro、Met和 Phe，游離氨基酸含量較高者為 Glu、Pro、Asp、Arg、Gly和 Ala。相對分子質量分布范圍為0至6 918 Da，其中1 084 Da以下的比例達到88.91%。Nano LC-MS/MS共鑒定出源于2 287種肽段序列的107種蛋白質，其中種類最為豐富的蛋白為參與骨骼肌修復的蛋白及酶類。其中，得分大于30的前39種蛋白中與骨骼肌修復相關蛋白占38.46%，同時還發現參與組蛋白甲基化的組蛋白賴氨酸N-甲基轉移酶setd3，在翻譯過程中不可或缺、參與損傷RNA降解的泛素-40S核糖體蛋白S27a，促進癌細胞凋亡的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶TAO3，參與細胞損傷、可能成為神經防護藥物作用靶點的紐蛋白等功能蛋白[28-30]。總體來看，活性炭吸附烏雞肽中，這些小分子多肽主要參與機體骨骼肌損傷修復，同時還具有抗癌及細胞修復的多重作用。

值得注意，本研究中膠原蛋白的發現是在得分14至30之間，推測可能是由于活性炭的吸附作用，造成了一些蛋白水解肽段的丟失，這也說明了以膠原蛋白肽為目的的研究開發，盡量避免使用活性炭進行脫色處理。結合Nano LC-MS/MS分析技術提供的鑒定蛋白對應的水解肽段信息、有目的的經過多肽的分離和活性鑒定，可得到易于被人體吸收利用并具有特定生理活性的多肽，將能廣泛應用于食品、保健品、藥品及化妝品等領域。