槲皮素和蘆丁對豬肉肌原纖維蛋白結構的影響

邵曉，張寧，孫樂彤，趙雪，李玲

（臨沂大學生命科學學院，山東臨沂276000）

肌原纖維蛋白是肉類中含量最高最重要的蛋白質，占總蛋白的55%～60%，是人們日常生活中優質蛋白的主要來源。然而，肉類產品在加工過程中很容易發生蛋白質氧化從而導致產品質量下降，營養價值降低，甚至影響消費者的健康安全[1]。蛋白質氧化會導致蛋白質側鏈基團修飾，蛋白質大分子發生交聯聚集等，從而影響肉制品的色澤、保水性和口感[2]。因此控制蛋白質氧化，提高蛋白質的凝膠強度是近年來急需解決的首要問題。

多酚是天然植物中的一類生物活性物質，因其抗氧化活性高而廣泛應用于食品工業中。近年來關于肉制品中添加酚類化合物的研究也有報道。玫瑰提取物可以阻止牛肉餅中的蛋白質和脂質氧化[3]，500 mg/kg的茶多酚可以降低肉糜制品中脂肪氧化硫代巴比妥酸反應物含量（thiobarbituric acid-reactive substances，TBARS）和蛋白質羰基的含量，降低了肉糜中蛋白的巰基含量，增加了肉糜凝膠的蒸煮損失[4]。低濃度的綠茶提取物能保持肉蛋白結構和氧化穩定性，而高濃度綠茶提取物導致肉的持水力降低，質構變差[5]。酚類化合物既有促氧化又有抑制氧化的效果，取決于酚的種類和濃度，兒茶素、槲皮素和蘆丁在高濃度時具有促氧化作用[6]。低濃度綠原酸能有效抑制羰基的生成，適量綠原酸抑制了蛋白質的氧化[7]。低濃度綠原酸使肌原纖維蛋白結構展開，凝膠增強，高濃度綠原酸使蛋白質交聯聚集，溶解度下降，凝膠被破壞[8]。蘆丁是槲皮素的蕓香糖苷，蘆丁水解后生成槲皮素，二者都是強抗氧化劑。目前關于槲皮素和蘆丁對蛋白質結構的影響幾乎沒有報道。本研究選用槲皮素和蘆丁這兩種多酚化合物，研究其在氧化體系中對蛋白質氨基酸側鏈結構的影響，為多酚在肉類加工中的實際應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬背最長?。菏惺?；槲皮素和蘆丁（純度為98%）：臨鑫正實驗器材有限公司；KCl、MgCl2、乙二醇雙（2-氨基乙基醚）四乙酸 [Ethylenebis（oxyethylenenitrilo）tetraacetic acid，EGTA]、Na2HPO4、NaCl、NaOH、CuSO4、FeCl3、H2O2、HCl、三羥 甲 基氨基甲烷 [tris（hydroxymethyl）methyl aminomethane，Tris]、 乙二胺四乙酸二 鈉（ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt，EDTA-2Na）、二甲亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、酒石酸鉀鈉、溴酚藍（bromophenol blue，BPB）、抗壞血酸、甘氨酸、Ellman試劑等（以上試劑均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Allegra 25R高速冷凍離心機：美國Beckman公司；F-4600熒光分光光度計：日本日立公司；H-S4數顯恒溫水浴鍋：金壇市醫療儀器廠；優普UPW系列超純水器：成都超純科技有限公司；Spectrum紫外可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 肌原纖維蛋白的提取

參考Park等[10]和Feng等[11]的方法并略作修改。在市場上購買最新鮮的豬背最長肌，用刀剔除豬肉上多余的筋膜、脂肪后，將豬肉切成均勻的小塊并用絞肉機攪碎后稱重，所得的肉糜用于提取豬肉肌原纖維蛋白。稱取50 g肉樣，加4倍體積的pH 7.0緩沖液勻漿離心，棄上清液，沉淀重復洗滌3遍。沉淀再加入4倍體積的0.1 mol/L NaCl洗液，勻漿離心，棄上清液，重復2次，第3次加洗液勻漿后，用4層紗布過濾以除去結締組織等，最后用0.1 mol/L HCl調pH值為6.2后離心去上清液，所得膏狀物為肌原纖維蛋白。

1.3.2 設計與處理

肌原纖維蛋白用20 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.0）稀釋為50 mg/mL，槲皮素和蘆丁分別用DMSO配制20 mmol/L的溶液。試管中先加入蛋白溶液，再加入不同量的槲皮素或蘆丁溶液，攪拌均勻后加入羥自由基氧化體系（終濃度0.01mmol/L FeCl3、0.1 mmol/L抗壞血酸、10 mmol/L H2O2），4 ℃氧化 12 h。肌原纖維蛋白的終濃度是40 mg/mL，槲皮素或蘆丁的終濃度分別是0、0.1、0.2、1、2 mmol/L。氧化反應通過添加 EDTA 終止（終濃度1 mmol/L）。以未加槲皮素、蘆丁和氧化劑的蛋白溶液作為空白對照組。

1.4 物理化學性能的測定

游離巰基含量采用DTNB法進行測定[12]。將樣品用甘氨酸緩沖溶液（0.086 mol/L Tris，0.09 mol/L甘氨酸，4 mmol/LEDTA，pH 8.0）緩沖溶液稀釋至 1 mg/mL，吸取 1.5 mL，加入 15 μL Ellman 試劑，振蕩放置 1 h，使之充分反應，離心（12 000 g，10 min）后取上清液，在412 nm處測定吸光度。

疏水性測定采用溴酚藍結合法進行，參照Chelh等[13]描述的方法將肌原纖維蛋白用20 mmol磷酸鹽緩沖溶液稀釋為5 mg/mL的蛋白溶液。取1 mL加入0.2 mL的1 mg/mL溴酚藍（BPB），充分混勻，離心用上清液在595 nm測定吸光值。

二聚酪氨酸含量參考李學鵬等[14]方法，利用F-4600熒光分光光度儀測定吸光度，激發波長選擇325 nm，發射波長為420 nm，狹縫寬度均為10 nm，靈敏度為2。

內源色氨酸熒光的變化通過F-4600熒光分光光度儀進行檢測。用20 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6）將樣品稀釋為蛋白濃度0.1 mg/mL，吸取0.1 mL置于石英比色皿中，室溫條件下283 nm激發，記錄下300 nm～400 nm的發射光譜供后續分析。

1.5 統計分析

用SPSS 18.0統計軟件進行單因素方差分析和Duncan’s進行多重比較。所有試驗重復進行3次。結果表示為平均值±標準差。

2 結果與分析

2.1 多酚對豬肉肌原纖維蛋白中游離巰基含量的影響

多酚對氧化體系中肌原纖維蛋白游離巰基含量的影響見圖1。

圖1 多酚對氧化體系中肌原纖維蛋白游離巰基含量的影響Fig.1 Effect of polyphenols on the free sulfydryl of myofibrillar protein under oxidation conditions

從圖1中可以看出，添加槲皮素后，肌原纖維蛋白游離巰基的含量與對照組差異不顯著（p＞0.05）。然而蘆丁與槲皮素不同，蘆丁具有提高游離巰基的作用。1 mmol/L和2 mmol/L蘆丁組的游離巰基含量顯著高于對照組（p＜0.05）。蘆丁有效抑制了蛋白質氧化，在添加量為1 mmol/L和2 mmol/L時，隨著濃度的上升，游離巰基含量顯著升高，高濃度多酚對氧化體系中肌原纖維蛋白側鏈基團有保護作用。李玲等[7]前期對綠原酸抑制肌原纖維蛋白氧化研究中發現，隨著綠原酸濃度的增加，游離巰基和總巰基含量增加，與該研究結果一致。而在研究草魚肌原纖維蛋白凍藏過程中的變化時，發現隨冷凍時間的延長，總巰基和游離巰基含量逐漸降低[15]。而本研究中，蘆丁使巰基含量增加，而槲皮素作用效果不顯著，其原因可能與氧化劑與抗氧化劑的濃度比例不同有關，還有抗氧化劑的結構基團與其功效存在一定的構效關系。

2.2 多酚對豬肉肌原纖維蛋白表面疏水性的影響

多酚對氧化體系中肌原纖維蛋白表面疏水性的影響見圖2。

圖2 多酚對氧化體系中肌原纖維蛋白表面疏水性的影響Fig.2 Effect of polyphenols on the BPB content of myofibrillar protein under oxidation conditions

由圖2可知，添加槲皮素和蘆丁后，能顯著增加肌原纖維蛋白的表面疏水性。隨著槲皮素的增加，肌原纖維蛋白的疏水性呈上升趨勢，其中0.2 mmol/L～2 mmol/L組與對照組和0.1 mmol/L組差異顯著（p＜0.05）。隨著蘆丁含量的增加，肌原纖維蛋白的疏水性也呈上升趨勢，與槲皮素組的變化趨勢一致。高濃度的多酚進一步促進了蛋白結構的展開，更多疏水性氨基酸暴露在蛋白分子表面[16]，疏水性增加。有研究表明，在肌原纖維蛋白中添加不同濃度的沒食子酸，疏水性會持續增加，高濃度沒食子酸作用效果更明顯，與該試驗結果一致，多酚促進了蛋白質結構的展開[17]。

2.3 多酚對豬肉肌原纖維蛋白二聚酪氨酸含量的影響

多酚對氧化體系中肌原纖維蛋白二聚酪氨酸含量的影響見圖3。

圖3 多酚對氧化體系中肌原纖維蛋白二聚酪氨酸含量的影響Fig.3 Effect of polyphenols on the dityrosine of myofibrillar protein under oxidation conditions

隨著槲皮素的增加，肌原纖維蛋白的二聚酪氨酸含量呈下降趨勢。槲皮素添加1 mmol/L和2 mmol/L組與對照組差異顯著（p＜0.05），說明槲皮素具有抑制蛋白質側鏈氨基酸的聚合作用，可以降低二聚酪氨酸的含量。而0.1 mmol/L和0.2 mmol/L組與對照組差異不顯著（p＞0.05），說明低含量的槲皮素抑制氨基酸聚合作用的效果較差。隨著蘆丁含量的增加，肌原纖維蛋白的二聚酪氨酸含量也呈下降趨勢，與槲皮素組的變化趨勢一致。說明槲皮素和蘆丁都具有抑制蛋白質側鏈氨基酸的聚合作用，保護蛋白質免受氧化攻擊。酪氨酸對羥自由基很敏感，易被氧化發生聚合反應而生成二聚酪氨酸。有研究發現肌原纖維蛋白氧化后二聚賴氨酸含量增加[18]。有人在研究兩種自由基氧化大黃魚肌原纖維蛋白時均發現，隨氧化劑濃度的升高，二聚酪氨酸含量顯著增加[19]。有研究在肌原纖維蛋白中添加一定濃度的鞣酸或沒食子酸，能抑制二聚酪氨酸含量的增加[20]。這是因為抗氧化劑酚類物質在氧化體系中普遍能夠起到清除自由基的作用，保護蛋白質側鏈基團，進而維持蛋白質的空間結構[21-22]。

2.4 多酚對豬肉肌原纖維蛋白內源色氨酸熒光強度的影響

槲皮素對氧化體系中肌原纖維蛋白內源色氨酸熒光強度見圖4。

蛋白質氧化處理后，隨著槲皮素含量的增加，內源色氨酸熒光強度逐漸降低。特別是在高濃度時，這可能是由于MP結構的進一步展開以及槲皮素與色氨酸殘基的相互作用引起的。槲皮素又名五羥黃酮，其羥基具有金屬離子螯合劑或油脂等氧化過程中產生的游離基團接受體的功能，可作為油脂、抗壞血酸的抗氧化劑。

蘆丁對氧化體系中肌原纖維蛋白內源色氨酸熒光強度見圖5。

圖4 槲皮素對氧化體系中肌原纖維蛋白內源色氨酸熒光的影響Fig.4 Effect of quercetin on tryptophan fluoescence of myofibrillar protein under oxidation conditions

圖5 蘆丁對氧化體系中肌原纖維蛋白內源色氨酸熒光的影響Fig.5 Effect of rutinum on tryptophan fluoescence of myofibrillar protein under oxidation conditions

隨著蘆丁添加量的增加，內源色氨酸熒光強度逐漸降低，2 mmol/L組熒光強度最低，這與槲皮素的添加效果一致。蘆丁是槲皮素的蕓香糖苷，蘆丁水解后生成槲皮素。二者在結構上有共同處，在影響色氨酸內源熒光強度的變化趨勢上一致。與此類似，綠原酸和沒食子酸也具有降低肌原纖維蛋白內源色氨酸熒光強度的作用[7-8，23]。

3 結論

在氧化體系中，不同濃度的槲皮素和蘆丁可以有效抑制豬肉肌原纖維蛋白的氧化。蘆丁可以增加游離巰基含量，而槲皮素在此濃度范圍內，對游離巰基含量影響不大。槲皮素和蘆丁都具有增加肌原纖維蛋白表面疏水性，降低二聚酪氨酸和內源色氨酸熒光值的作用。由此可見，多酚對自由基引起的氧化起到一定的抑制作用?？梢酝ㄟ^向肉制品中添加一定量的多酚化合物防止蛋白質氧化。