丙烯酰胺和苯并芘誘導(dǎo)秀麗隱桿線蟲(chóng)生殖腺細(xì)胞凋亡研究

聶文，屠澤慧，郭肖穎，蔡克周，*

（1.合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，安徽合肥230009；2.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)工程研究所，安徽合肥230001）

丙烯酰胺（Acrylamide，AA）是一種無(wú)色無(wú)味的結(jié)晶固體，可溶于水、丙酮和乙醇中，20世紀(jì)50年代以來(lái)，它被廣泛應(yīng)用于聚丙烯酰胺的工業(yè)化生產(chǎn)和實(shí)驗(yàn)室的電泳和分析研究[1]。AA對(duì)動(dòng)物具有公認(rèn)的神經(jīng)毒性和生殖毒性[2]，還可誘發(fā)小鼠、大鼠和斑馬魚(yú)等多種動(dòng)物腫瘤[3-4]，也是一種可能的人類致癌物（2A類）[5]。2002年，瑞典科學(xué)家最先發(fā)現(xiàn)富含碳水化合物的食品在高于120℃的加工（如烹飪，油炸或烘烤）過(guò)程中，能生成μg/kg級(jí)的AA[6]，這些AA主要是由食物中游離的天冬酰胺和還原糖在高溫條件通過(guò)美拉德反應(yīng)形成[7-9]，同年，WHO對(duì)全球2000多個(gè)食品抽檢顯示，許多高溫加工食品中AA含量高達(dá)飲用水限定標(biāo)準(zhǔn)的500倍，基于此，瑞典國(guó)家食品管理局向全世界發(fā)出食用高溫油炸和烘烤食品可能會(huì)導(dǎo)致的AA暴露健康風(fēng)險(xiǎn)的警告[10]。2018年3月28日，美國(guó)加利福尼亞州洛杉磯高等法院裁定，在加利福尼亞州出售咖啡的企業(yè)必須在咖啡產(chǎn)品包裝上，須標(biāo)注““致癌警示””信息，原因是咖啡豆在烘焙過(guò)程中產(chǎn)生可能致癌的AA。這一新聞再次激起人們對(duì)食品內(nèi)源化學(xué)危害物的關(guān)注。

苯并芘（Benzo（a）pyrene，BaP）是另外一個(gè)普遍關(guān)注的化學(xué)性危害物，BaP是由一個(gè)苯環(huán)和一個(gè)芘分子稠合而成的多環(huán)芳烴類化合物，是最早發(fā)現(xiàn)的環(huán)境致癌物。BaP最初是在化石燃料和木材等有機(jī)物燃燒煙霧中發(fā)現(xiàn)，后發(fā)現(xiàn)廣泛分布在自然環(huán)境中。上世紀(jì)80年代在熏魚(yú)中檢出BaP后，陸續(xù)在多種食品中經(jīng)檢測(cè)出，尤其是在熏魚(yú)、烤腸、炸雞、植物油、谷物和經(jīng)過(guò)高溫?zé)峒庸ぬ幚淼氖称穂11-13]。人類可通過(guò)皮膚、呼吸、飲水和食物等多種途徑接觸到BaP，其中通過(guò)食品途徑攝入BaP占90%以上[14]。世界各國(guó)均對(duì)食品中BaP的殘留量進(jìn)行了嚴(yán)格限制。我國(guó)對(duì)食品中BaP的限量標(biāo)準(zhǔn)為肉制品、熏烤動(dòng)物性食品及糧食小于5.0 μg/kg、植物油小于10 μg/kg[15]。歐盟對(duì)BaP的最大限量為熏烤肉制品 5.0 μg/kg、食用油 2.0 μg/kg、谷類及嬰幼兒食品 1.0 μg/kg[16]。

由于食品攝入造成AA和BaP對(duì)人的廣泛暴露，科學(xué)家們圍繞AA和BaP的快速檢測(cè)、形成機(jī)制和控制措施方面開(kāi)展了大量工作，此外，以離體細(xì)胞、嚙齒動(dòng)物和其他生物模型為對(duì)象，在AA和BaP致毒特點(diǎn)和機(jī)理方面做了大量研究，但現(xiàn)有研究都是獨(dú)立以AA或BaP暴露染毒為研究對(duì)象，綜合考慮AA和BaP通過(guò)食物攝入造成共同暴露的普遍性，研究AA和BaP共同暴露染毒的協(xié)同作用至今尚未見(jiàn)報(bào)道。本文以經(jīng)典模式生物秀麗隱桿線蟲(chóng)為模型，線蟲(chóng)是一種開(kāi)展化學(xué)污染物生物學(xué)毒性評(píng)價(jià)的好材料，選取簡(jiǎn)單、直接、易測(cè)的生物學(xué)終點(diǎn)是利用好模式生物的重要前提，線蟲(chóng)生殖腺具有良好的發(fā)育延展性，細(xì)胞凋亡具有穩(wěn)定的規(guī)律，受到環(huán)境應(yīng)激或毒物損失，會(huì)誘發(fā)細(xì)胞凋亡增加，性腺細(xì)胞凋亡終點(diǎn)已被應(yīng)用于重金屬、農(nóng)殘、化學(xué)藥物和活性提取物的毒理和活性評(píng)價(jià)[17]。本試驗(yàn)選擇秀麗隱桿線蟲(chóng)性腺細(xì)胞凋亡和后代數(shù)量為生物學(xué)終點(diǎn)，研究AA和BaP誘導(dǎo)生殖腺細(xì)胞凋亡的劑量和時(shí)間效應(yīng)，考察AA和BaP的協(xié)同致毒性，為AA合理評(píng)估提供更多理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與線蟲(chóng)

AA（超純級(jí)，≥99.9%）：阿拉丁試劑公司，用雙蒸水配制成2.0 g/L溶液過(guò)濾滅菌后分裝在1.5 mL離心管；BaP（色譜級(jí)，≥99.9%）：sigma試劑公司，用無(wú)水乙醇配制成0.01 g/L溶液過(guò)濾滅菌后分裝在1.5 mL離心管，每次使用前取樣稀釋。

野生型秀麗隱桿線蟲(chóng)N2、線蟲(chóng)食物大腸桿菌OP50：國(guó)際線蟲(chóng)中心（Caenorhabditis Genetics Center，CGC）提供，在實(shí)驗(yàn)室里，線蟲(chóng)正常在（20±1）℃溫度范圍內(nèi)培養(yǎng)。

1.2 線蟲(chóng)的同步化處理

用線蟲(chóng)基礎(chǔ)培養(yǎng)液（2.922 g NaCl，2.236 g KCl，溶于1 000 mL雙蒸水，高壓滅菌）將懷卵成蟲(chóng)從線蟲(chóng)生長(zhǎng)培養(yǎng)基（nematode growth media，NGM）平板洗下，加入到1.5 mL離心管中，使總體積達(dá)到0.7 mL，然后加入0.3 mL裂解液（5 mol/L NaOH∶5%NaClO=1∶2，體積比，現(xiàn)配現(xiàn)用），間歇彈擊混勻，裂解結(jié)束后立即在1 400 g離心力下離心，移上清，再用線蟲(chóng)基礎(chǔ)培養(yǎng)液清洗2次，最后將蟲(chóng)卵于線蟲(chóng)基礎(chǔ)培養(yǎng)液中過(guò)夜孵化，由于沒(méi)有添加食物，線蟲(chóng)全部滯留在L1期[18]。

1.3 生殖腺細(xì)胞凋亡數(shù)的測(cè)定

細(xì)胞凋亡的測(cè)定依Wang所采用方法進(jìn)行修改[17]，將處理后的線蟲(chóng)置于24孔板內(nèi)，加入500 μL含少量OP50的線蟲(chóng)基礎(chǔ)培養(yǎng)液，以25 μg/mL的吖啶橙染色1 h，將蟲(chóng)吸出于Ф35 mm NGM板上恢復(fù)45 min，挑取20條線蟲(chóng)于30 μL NaN3的載玻片中央，熒光顯微鏡觀察，凋亡的細(xì)胞呈亮黃色或橙黃色，這是DNA片斷化的一個(gè)重要標(biāo)志，而未凋亡的細(xì)胞呈現(xiàn)均勻的淺綠色，改進(jìn)后的方法染色更加清楚。

1.4 線蟲(chóng)后代數(shù)目測(cè)定

線蟲(chóng)后代數(shù)量目的測(cè)定參考前人方法[17]，將15只同步化早期成蟲(chóng)分別單個(gè)移入24孔板內(nèi)，加入500 μL不同濃度AA和BaP含少量OP50的線蟲(chóng)基礎(chǔ)培養(yǎng)液，1天后將成蟲(chóng)移入新孔板內(nèi)，以保證不被后代線蟲(chóng)所混淆，直到線蟲(chóng)停止產(chǎn)卵，線蟲(chóng)在24孔板內(nèi)所產(chǎn)蟲(chóng)卵經(jīng)培養(yǎng)1天后對(duì)孵化線蟲(chóng)進(jìn)行計(jì)數(shù)，即為后代數(shù)量。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用OriginPro 7.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，顯著性檢驗(yàn)采用Student’s t-tests方法，p＜0.05表示差異顯著。所有數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤的形式表示，利用雙尾t檢驗(yàn)檢測(cè)不同品系線蟲(chóng)重金屬暴露所導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡的差異，顯著性水平為p＜0.05。

2 結(jié)果分析

2.1 AA暴露誘導(dǎo)線蟲(chóng)生殖細(xì)胞凋亡

不同濃度AA暴露線蟲(chóng)12小時(shí)后性腺細(xì)胞凋亡的情況如圖1所示。

圖1 不同AA濃度對(duì)線蟲(chóng)生殖腺細(xì)胞凋亡的影響Fig.1 Effect on the gonad cells apoptosis of C.elegans with different concentration of AA

如圖1所示，隨著AA濃度的增加，線蟲(chóng)性腺細(xì)胞凋亡呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，當(dāng)AA濃度在0.5 mg/L濃度范圍以內(nèi)時(shí)，細(xì)胞凋亡增加不明顯，當(dāng)暴露濃度達(dá)到2.0 mg/L和10.0 mg/L時(shí)，線蟲(chóng)性腺細(xì)胞凋亡數(shù)目由對(duì)照組1.88±0.11分別增加到 3.35±0.21 和 4.1±0.25，差異均顯著（p＜0.05）。進(jìn)一步研究較低AA劑量暴露對(duì)線蟲(chóng)性腺細(xì)胞凋亡作用的時(shí)間效應(yīng)，線蟲(chóng)于0.2 mg/L AA濃度下暴露不同時(shí)間效應(yīng)如圖2所示。

如圖2所示，無(wú)論線蟲(chóng)是否有AA暴露處理，其性腺細(xì)胞凋亡均隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加，24小時(shí)后各組線蟲(chóng)性腺細(xì)胞凋亡數(shù)均較0 h組顯著增加（p＜0.05），但是整個(gè)暴露時(shí)間內(nèi)（36 h），相比對(duì)照組，AA暴露并不能誘發(fā)性腺細(xì)胞凋亡數(shù)顯著增加（p＞0.05）。

圖2 低濃度AA暴露誘發(fā)線蟲(chóng)性腺細(xì)胞凋亡的時(shí)間效應(yīng)Fig.1 Effect on the gonad cells apoptosis of C.elegans induced by AA with exposure time

2.2 BaP暴露誘導(dǎo)線蟲(chóng)生殖細(xì)胞凋亡

不同濃度BaP暴露線蟲(chóng)12小時(shí)后性腺細(xì)胞凋亡的情況如圖3所示。

如圖3所示，在考察的BaP濃度（0～0.005 mg/L）范圍內(nèi)，線蟲(chóng)性腺細(xì)胞凋亡呈現(xiàn)先增加后降低的情況，0.000 5 mg/L濃度范圍內(nèi)BaP沒(méi)有誘發(fā)性腺細(xì)胞凋亡顯著增加，0.001 mg/L BaP處理組線蟲(chóng)性腺細(xì)胞凋亡數(shù)由對(duì)照組1.85±0.11增加到3.2±0.18，差異顯著（p＜0.05），而在0.005 mg/L劑量條件下，性腺細(xì)胞凋亡水平反而下降，這可能是過(guò)高的濃度可能導(dǎo)致性腺發(fā)育的阻滯。0.000 2 mg/L濃度BaP暴露對(duì)線蟲(chóng)性腺細(xì)胞凋亡的時(shí)間效應(yīng)如圖4所示。

圖3 不同BaP濃度對(duì)線蟲(chóng)性腺細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Effect on the gonad cells apoptosis of C.elegans with different concentration of BaP

圖4 低濃度BaP暴露誘發(fā)線蟲(chóng)性腺細(xì)胞凋亡的時(shí)間效應(yīng)Fig.4 Effect on the gonad cells apoptosis of C.elegans induced by BaP with exposure time

如圖4所示，線蟲(chóng)性腺細(xì)胞凋亡均隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加，24 h和36 h檢測(cè)點(diǎn)相比0 h檢測(cè)點(diǎn)，線蟲(chóng)性腺細(xì)胞凋亡數(shù)均顯著增加（p＜0.05），但是整個(gè)暴露時(shí)間內(nèi)（36 h），0.000 2 mg/L濃度BaP暴露處理并不能誘發(fā)性腺細(xì)胞凋亡數(shù)顯著增加（p＞0.05）。

2.3 AA和BaP暴露協(xié)同誘導(dǎo)線蟲(chóng)生殖細(xì)胞損傷

為了研究AA和BaP暴露對(duì)性腺細(xì)胞的協(xié)同損傷作用，將線蟲(chóng)暴露于含有0.2 mg/L AA和0.000 2 mg/L BaP環(huán)境中，結(jié)果如圖5所示。

圖5 AA和BaP暴露協(xié)同誘導(dǎo)線蟲(chóng)性腺細(xì)胞凋亡的時(shí)間效應(yīng)Fig.5 Effect on the gonad cells apoptosis of C.elegans induced by AA and BaP

如圖5所示，與前面研究相同的是處理組和對(duì)照組線蟲(chóng)性腺細(xì)胞凋亡均隨時(shí)間延伸而呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，相比對(duì)照組，在12小時(shí)后染毒組性腺細(xì)胞凋亡顯著增加（p＜0.05），其后盡管對(duì)照組凋亡細(xì)胞數(shù)也有明顯增加，但是染毒組增加更加明顯，結(jié)果表明AA和BaP暴露對(duì)線蟲(chóng)性腺具有明顯的協(xié)同作用。進(jìn)一步考察低濃度AA和BaP暴露對(duì)線蟲(chóng)后代數(shù)量的影響，結(jié)果如圖6所示。

圖6 AA和BaP暴露誘導(dǎo)線蟲(chóng)后代數(shù)量降低Fig.6 Effectonthebroodsizeof C.elegans inducedbyAAandBaP

如圖6所示，0.2 mg/L水平AA和0.000 2 mg/L水平BaP均不能誘發(fā)線蟲(chóng)后代數(shù)量的顯著降低，但共同染毒處理則導(dǎo)致后代數(shù)量由對(duì)照組110±7.2降低到75±6.2，差異顯著（p＜0.05），結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了 AA 和BaP能協(xié)同誘發(fā)線蟲(chóng)生殖損傷。

3 討論

線蟲(chóng)生殖腺是AA和BaP暴露毒性良好的生物學(xué)檢測(cè)終點(diǎn)。自1974年Brenner[19]最先提出利用秀麗隱桿線蟲(chóng)進(jìn)行環(huán)境毒理學(xué)研究的可行性，作為一種活體生物，其3 d～4 d相對(duì)較短的生殖周期和4周左右的壽命，是一種良好的開(kāi)展活體研究的生物模型，經(jīng)過(guò)多年發(fā)展，線蟲(chóng)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于環(huán)境化學(xué)污染物毒理評(píng)價(jià)等方面的研究。早期，主要以線蟲(chóng)致死或半致死為檢測(cè)終點(diǎn)，評(píng)價(jià)化學(xué)污染物的急性毒性[20]，后來(lái)發(fā)展了以線蟲(chóng)發(fā)育狀況[21]、繁殖性能[22]、壽命[23]和攝食行為[24]等非致死生物學(xué)終點(diǎn)，應(yīng)用于重金屬、農(nóng)殘、化學(xué)藥物和空氣負(fù)離子等環(huán)境因子的生物學(xué)評(píng)價(jià)。但是急性致死試驗(yàn)所暴露劑量通常較高，與實(shí)際環(huán)境中污染物濃度相差甚遠(yuǎn)，而非致死性檢測(cè)點(diǎn)，如壽命和攝食行為等有存在周期相對(duì)較長(zhǎng)和難以控制等不利因素。Kazuhiro等將線蟲(chóng)進(jìn)行BaP急性染毒，檢測(cè)其半致死劑量為0.05 mg/L[25]，而Li檢測(cè)線蟲(chóng)暴露染毒AA的半致死劑量高達(dá)897 mg/L，誘發(fā)攝食行為發(fā)生明顯變化的劑量為10 mg/L[26]，Wang以線蟲(chóng)生殖腺為研究體系，研究了重金屬砷對(duì)生殖腺的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)較低濃度砷即可誘導(dǎo)性腺周期阻滯和細(xì)胞凋亡，表明線蟲(chóng)的生殖腺是研究化學(xué)污染物毒性的良好模型[27]。

線蟲(chóng)具有一對(duì)U形的生殖腺，兩個(gè)生殖腺臂通過(guò)中央的子宮相連。成體線蟲(chóng)生殖腺的遠(yuǎn)端細(xì)胞是生殖干細(xì)胞，終身具有絲分裂能力，遠(yuǎn)端往后是一段約20個(gè)細(xì)胞直徑的過(guò)渡區(qū)，有絲分裂和減數(shù)分裂同時(shí)存在，過(guò)渡區(qū)之后是減數(shù)分裂區(qū)，染色體在此區(qū)域形成聯(lián)會(huì)復(fù)合體。在正常生理?xiàng)l件下，為維持生殖細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)，約50%的有絲分裂細(xì)胞會(huì)在發(fā)育過(guò)程中凋亡，這一過(guò)程謂之“生理性細(xì)胞凋亡”，當(dāng)受到環(huán)境危害物脅迫時(shí)，細(xì)胞凋亡數(shù)目顯著增加[28]。在本試驗(yàn)中，我們測(cè)定了AA和BaP暴露下線蟲(chóng)生殖細(xì)胞凋亡，通過(guò)對(duì)不同濃度（0～0.005 mg/L）AA 和（0～10.0 mg/L）BaP 暴露的研究發(fā)現(xiàn)，它們均可誘導(dǎo)線蟲(chóng)生殖細(xì)胞凋亡增加，并與濃度密切相關(guān)，2.0 mg/L的AA暴露12 h可誘發(fā)線蟲(chóng)生殖腺細(xì)胞顯著增加，而對(duì)于BaP在相同處理時(shí)間內(nèi)誘發(fā)生殖腺細(xì)胞顯著增加的劑量只要0.001 mg/L，這也表明BaP的生物學(xué)毒性要高AA達(dá)千倍以上。此外，BaP誘發(fā)的生殖細(xì)胞具有多效性，較低濃度（0.000 2 mg/L）BaP暴露誘導(dǎo)生殖細(xì)胞凋亡增加，而較高濃度（0.001 mg/L）暴露對(duì)細(xì)胞凋亡具有抑制作用。產(chǎn)生這種效應(yīng)的原因可能與誘發(fā)生殖腺的發(fā)育阻滯有關(guān)，發(fā)育阻滯導(dǎo)致生殖細(xì)胞總數(shù)的降低，從而表現(xiàn)出凋亡細(xì)胞數(shù)目的下降。相比BaP半致死劑量為0.05 mg/L和AA半致死劑量897 mg/L，線蟲(chóng)生殖腺細(xì)胞凋亡檢測(cè)點(diǎn)敏感濃度分別降低了50倍和450倍。這也表明線蟲(chóng)生殖腺是AA和BaP暴露毒性良好的生物學(xué)檢測(cè)終點(diǎn)。

流行病學(xué)研究顯示，由于食品造成AA和BaP的攝入占據(jù)化學(xué)污染物接觸的主要部分，油炸和烘烤食品因其固有風(fēng)味和便捷性特點(diǎn)，是被世界各國(guó)廣為喜愛(ài)的食品，這些食品也是人們主要的AA攝入源，此外高溫加工過(guò)程中，脂肪酸環(huán)化和蛋白質(zhì)的裂解也可以生產(chǎn)不同水平的BaP[15，29]。同樣，煙熏和燒烤類食品的攝入與煙草的消費(fèi)也會(huì)伴隨著化學(xué)危害物BaP的接觸[11，14]。AA和BaP在動(dòng)物和人體內(nèi)或離體的生物學(xué)作用是否存在協(xié)同目前還沒(méi)有報(bào)道。在本試驗(yàn)中，我們測(cè)定了0.2 mg/L的AA和0.000 2 mg/L的BaP單獨(dú)暴露時(shí)，在36 h內(nèi)都不能誘發(fā)線蟲(chóng)生殖腺細(xì)胞凋亡的顯著增加，但是將這一劑量的AA和BaP共同暴露線蟲(chóng)時(shí)，在暴露12 h時(shí)，就檢測(cè)到生殖腺細(xì)胞凋亡的顯著增加，并隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，處理組線蟲(chóng)生殖腺細(xì)胞凋亡較生理性凋亡呈現(xiàn)明顯的增加趨勢(shì)，這表明AA和BaP對(duì)生殖腺的毒理作用存在協(xié)同作用，而后代數(shù)量的顯著下降對(duì)這一協(xié)同作用更進(jìn)一步驗(yàn)證。