鐵皮石斛花多糖提取工藝及體外抗氧化性研究

繆園欣，廖明星，孫愛紅，李蓉，*

（1.荊楚理工學院生物工程學院，湖北荊門448000；2.湖北省荊門市畜牧獸醫局，湖北荊門448000）

鐵皮石斛（Dendrobium officinale）是蘭科石斛屬多年生草本植物，是我國傳統的名貴中草藥，素有“救命仙草”之稱[1-2]。現代藥理學研究發現鐵皮石斛具有益胃生津、滋陰清熱、抗氧化、降血糖等功能，此外研究還發現其對心血管和免疫系統疾病具有顯著的療效[2-4]。化學成分分析發現鐵皮石斛含有生物堿、水溶性多糖、黃酮等生物活性成分[5-8]。石斛屬植物一直以莖為藥，而花未被藥用。近年來，隨著鐵皮石斛大規模的種植，鐵皮石斛花產量急增，造成了極大的資源浪費[9]。為了充分利用鐵皮石斛花資源，對鐵皮石斛花進行化學成分分析，發現其含有較豐富多糖、浸出物及氨基酸等營養成分[10-11]。多糖是一類廣泛存在于微生物、植物細胞壁和動物細胞膜中的復雜糖類物質，具有抗氧化、抗腫瘤、調節免疫等藥理作用[12-14]。本試驗采用超聲波-微波協同法對鐵皮石斛花多糖的提取工藝進行優化，并對鐵皮石斛花多糖的體外抗氧化性進行研究，為鐵皮石斛花的開發及生物活性研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

鐵皮石斛花：湖北洲和生態農業發展有限公司；1，1-二苯基基苯肼（1，1-dipheny 1-2-picrylhydrazyl，DPPH）：Sigma公司；硫酸亞鐵、雙氧水、水楊酸、葡萄糖、濃硫酸、苯酚、乙醇：上海凌峰化學試劑有限公司；試驗用水為離子交換水。

EG823LC5-NR型微波爐：佛山市順德區美的微波電器制造有限公司；TY-1901型分光光度計：北京普析通用儀器有限公司；YJ1002型電子天平：上海浦春計量儀器有限公司；TG16-WS型低速臺式離心機：上海安亭科學儀器廠；KQ-100KDB型高功率數控超聲波清洗機：昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 材料處理

取鐵皮石斛花于60℃烘箱中烘干，然后用萬能粉碎機粉碎，經40目篩得石斛花粉末備用。

1.2.2 葡萄糖標準曲線的繪制

稱取100 mg于105℃干燥至恒重的標準葡萄糖，置于100 mL容量瓶中，加適量蒸餾水溶解并稀釋至刻度，搖勻備用。精密吸取葡萄糖貯備液10 mL于100 mL容量瓶，用水稀釋至刻度，得0.1 mg/mL葡萄糖標準液。分別吸取葡萄糖標準液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于10 mL具塞刻度試管中，用蒸餾水補至1.0 mL，加入5%苯酚1 mL，搖勻，然后立即加入5 mL濃硫酸，搖勻靜置5 min，于90℃水浴加熱20 min，然后冰浴冷卻5 min，于488 nm波長處測吸光度。以葡萄糖標準溶液濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標繪制標準曲線[15-16]。

1.2.3 鐵皮石斛花多糖的測定

精密稱取1 g鐵皮石斛花粉，按不同的料液比加入蒸餾水，超聲波-微波協同提取一定時間。提取完成后去除濾渣、醇沉，將得到的沉淀重新溶于水，按1.2.2的方法（苯酚-硫酸法）操作測得多糖濃度，并依據下列公式計算得出多糖提取率：

式中：C為石斛花樣品中多糖的濃度，mg/mL；V為樣品溶液稀釋液體積，mL；N為稀釋倍數；m為樣品質量，g。

1.2.4 鐵皮石斛花多糖提取工藝優化試驗

1.2.4.1 料液比對多糖提取率的影響

準確稱取 1.000 g樣品，分別按 1∶20、1∶30、1∶40、1 ∶50、1 ∶60（g/mL）的料液比加入蒸餾水，超聲處理35 min，再在350 W微波功率下提取5 min。提取結束后定容，測定吸光度，并計算石斛花多糖提取率。

1.2.4.2 微波時間對多糖提取率的影響

準確稱取1.000 g樣品，按1∶40（g/mL）的料液比加入蒸餾水，超聲處理35 min，再分別在350 W微波功率下提取 1、3、5、7、9 min。提取結束后定容，測定吸光度，并計算石斛花多糖提取率。

1.2.4.3 超聲時間對多糖提取率的影響

準確稱取1.000 g樣品，按1∶40（g/mL）的料液比加入蒸餾水，分別超聲處理 15、25、35、45、55 min，再在350 W微波功率下提取5 min。提取結束后定容，測定吸光度，并計算石斛花多糖提取率。

1.2.4.4 微波功率對多糖提取率的影響

準確稱取1.000 g樣品，按1∶40（g/mL）的料液比加入蒸餾水，超聲處理45 min，再分別在250、300、350、400、450 W微波功率下提取5 min。提取結束后定容，測定吸光度，并計算石斛花多糖提取率。

1.2.5 提取工藝優化正交試驗設計

為了確定最佳提取條件，在單因素試驗的基礎上，以石斛花多糖提取率為試驗指標，設計L9（34）正交試驗，對料水比、微波時間、超聲時間、微波功率4個因素在3個不同水平上進行優化試驗，因素與水平見表1。

表1 多糖提取工藝條件優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment for polysaccharides extracting conditions optimization

1.2.6 鐵皮石斛花多糖體外抗氧化活性測定

1.2.6.1 DPPH自由基清除能力測定

取 2 mL 不 同濃 度（0.05、0.1、0.15、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL）的鐵皮石斛花多糖溶液于試管中，分別加入2.0 mL 0.1 mmol/L DPPH溶液，充分混勻后避光反應20 min，在517 nm處測定吸光度為Ai，VC做陽性對照；對照組以無水乙醇代替DPPH，測定吸光度Aj；空白組以蒸餾水代替多糖溶液，測定吸光度為A0[17]。

DPPH自由基清除率/%=[A0-Ai+Aj]/A0×100

1.2.6.2 羥基自由基清除能力測定

取 2 mL 不同 濃 度（0.05、0.1、0.15、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL）的石斛花多糖溶液，加入 2.0 mL 6 mmol硫酸亞鐵、2.0 mL 6 mmol/mL雙氧水，混勻后靜置10 min，各加入2.0 mL 6 mmol水楊酸，混勻后再靜置30 min，于510 nm處測吸光度Ai。以蒸餾水代替水楊酸測吸光值Aj，空白對照以2.0 mL蒸餾水代替石斛花多糖溶液測定吸光度A0[18]。

羥基自由基清除率/%=[A0-Ai+Aj]/A0×100

2 結果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線及回歸方程

以葡萄糖標準液濃度（mg/mL）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線見圖1。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 Standard curve of glucose

根據圖1，求得回歸方程A=8.941 4C-0.012 2。式中：C為葡萄糖含量，mg/mL；A為吸光度。相關系數R2為0.999 3，表明在該濃度范圍內葡萄糖濃度與吸光度線性關系良好。

2.2 鐵皮石斛花多糖提取單因素試驗

2.2.1 料液比對鐵皮石斛花多糖提取率的影響

料液比對鐵皮石斛花多糖提取率的影響見圖2。

圖2 料液比對多糖提取率的影響Fig.2 Impact of solid-liquid ratio on the extraction rate of polysaccharides

由圖 2 可知，料液比在 1 ∶20（g/mL）～1 ∶40（g/mL）范圍內，隨著溶劑的增加，固液接觸面積增加，多糖提取率提高；此后，繼續增加溶劑，由于單位體積溶劑吸收的超聲波、微波能量減少，溫度升高變慢不利于提取溶出[19]，多糖提取率呈下降趨勢。因此，鐵皮石斛花多糖提取時的最佳料液比為1∶40（g/mL）。

2.2.2 微波時間對鐵皮石斛花多糖提取率的影響

微波時間對鐵皮石斛花多糖提取率的影響見圖3。

圖3 微波時間對多糖提取率的影響Fig.3 Impact of microwave time on the extraction rate of polysaccharides

由圖3可知，微波時間在1 min～5 min范圍內，隨著微波時間的增加，鐵皮石斛花多糖提取率呈增加趨勢；當微波時間超過5 min時，由于長時間高溫作用，部分多糖結構被破壞，多糖提取率降低。因此，微波時間選擇5 min較為適宜，該條件下的鐵皮石斛花多糖具有較高的提取率。

2.2.3 超聲時間對多糖提取率的影響

超聲時間對多糖提取率的影響見圖4。

圖4 超聲時間對多糖提取率的影響Fig.4 Impact of ultrasonic time on the extraction rate of polysaccharides

由圖4可知，超聲時間在15 min～45 min范圍內，鐵皮石斛花多糖提取率隨超聲時間的延長而增加；當超聲時間超過45 min時，由于長時間的空化作用和機械振動作用破壞了部分多糖結構，多糖提取率下降。因此，鐵皮石斛花多糖提取的最佳超聲時間為45 min。

2.2.4 微波功率對多糖提取率的影響

微波功率對多糖提取率的影響見圖5。

由圖5可知，微波功率在250 W～400 W范圍內，隨著微波功率的增加，物質吸收微波能越多，有效成分浸出約多，鐵皮石斛花多糖提取率逐漸增加；此后，繼續升高微波功率，部分多糖在高功率作用下分解，多糖提取率下降。因此，選擇微波功率400 W為最佳微波功率。

圖5 微波功率對多糖提取率的影響Fig.5 Impact of microwave power on the extraction rate of polysaccharides

2.3 提取工藝優化正交試驗

為確定最佳提取條件，在單因素的基礎上，研究超聲時間、料液比、微波時間、微波功率對鐵皮石斛花多糖提取的影響，以石斛花多糖提取率為評價指標，進行L9（34）正交試驗。正交試驗結果見表2，方差分析結果見表3。

表2 提取工藝條件優化正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for extraction conditions optimization

表3 正交試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

通過表3中提取率的極差分析結果可知，影響提取率的各因素主次順序為超聲時間＞料液比＞微波功率＞微波時間。試驗指標提取率越大越好，從k值得出使石斛花多糖提取最佳的工藝條件為A3B3C1D3，即超聲時間為 55 min，料液比為 1 ∶50（g/mL），微波時間為3 min，微波功率為450 W，在此條件下石斛花多糖提取率最高，為7.22%。由表3方差分析結果可知，因素A、B、D對石斛花多糖提取率有極顯著影響（P＜0.01），因素C對石斛花多糖提取率無顯著影響（P＞0.05），對多糖提取率影響的主次順序為A＞B＞D＞C，即超聲時間＞料液比＞微波功率＞微波時間，與直觀分析結果一致。

2.4 鐵皮石斛花多糖體外抗氧化活性測定

2.4.1 清除DPPH自由基能力的測定

清除DPPH自由基能力的測定結果見圖6。

圖6 石斛花多糖對DPPH自由基清除率曲線Fig.6 Scavening curves of the polysaccharides from flowers of Dendrobium officinale DPPH radicals

在最優的超聲波-微波提取工藝下提取石斛花多糖，并對多糖進行清除DPPH自由基的活性測定，由圖6可知石斛花多糖對DPPH自由基的清除率呈現濃度依賴性，隨著多糖濃度的增加，清除率增加。

2.4.2 清除羥自由基能力的測定

清除羥自由基能力的測定結果見圖7。

圖7 石斛花多糖對羥自由基清除率曲線Fig.7 Scavening curves of the polysaccharides from flowers of Dendrobium officinale OH radicals

由圖7可知，石斛花多糖對羥自由基的清除率具有濃度依賴性，清除率隨濃度的增加而增加。

3 結論

本研究探討了鐵皮石斛花多糖的提取工藝，結果表明，各因素影響鐵皮石斛花多糖提取率的主次順序為：超聲時間＞料液比＞微波功率＞微波時間。通過單因素試驗及正交試驗確定超聲波-微波協同提取鐵皮石斛花多糖的最佳工藝條件為：超聲時間為55 min，料液比為1∶50（g/mL），微波時間為3 min，微波功率為450 W，在此條件下鐵皮石斛花多糖提取率為7.22%。對超聲波-微波協同提取的鐵皮石斛花多糖進行活性研究，發現鐵皮石斛花多糖有較好的抗氧化活性。這為鐵皮石斛花的深入研究及開發利用提供了一定的理論參考。