超聲波輔助雙水相萃取鮑魚內臟的β-葡萄糖苷酶

（廈門醫學院，福建廈門361021）

鮑魚是一種海洋貝類，只有半面外殼，屬單殼軟體動物，體型扁而寬，以攝食海藻和浮游生物為生[1]。鮑魚的天然產量很少，但隨著技術的發展，鮑魚人工繁殖已經成功實現。近年來，隨著我國水產行業的不斷發展，鮑魚養殖技術的應用和完善，我國的鮑魚產量也在不斷增加，而在鮑魚的加工過程中會產生大量的下腳料，如鮑魚內臟、鮑魚殼等，對于這些下腳料的處理以及高效應用問題也引起人們的關注。鮑魚內臟占鮑魚總質量的30%左右，其中含有大量的蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶等[2]，如何合理運用這些廉價而又豐富的天然海洋資源是十分值得研究的。

β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，CE3.2.1.21）又稱β-D-葡萄糖苷水解酶，別名纖維二糖酶、龍膽二糖酶和苦杏仁苷酶。它屬于纖維素酶類，是一種能催化水解芳基和烴基與糖基原子團之間的糖苷鍵生成葡萄糖的酶。β-葡萄糖苷酶對于纖維素的降解作用顯著，對于工業生產有十分重要的作用[3]。

雙水相萃取技術（aqueous two phase extraction，ATPE）作為近幾年發展較為迅猛的新型液-液萃取技術，與傳統分離技術相比具有高含水量（70%～90%）、分相時間短、條件溫和、易于工藝放大和連續操作等優點，在快速的將大量雜志去除的同時還能較好的保護生物活性物質，使其不易變性失活[4-5]。目前雙水相萃取技術已應用于蛋白質、生物酶、菌體、細胞以及氨基酸、抗生素等生物小分子物質的分離、純化[6]。

目前已有研究運用常規的冷提取方法分離純化出鮑魚內臟中的β-葡萄糖苷酶[7-8]，本研究則是在最佳冷提取條件下，加入超聲波破碎輔助常規方法提取鮑魚內臟中β-葡萄糖苷酶，并設計正交試驗法找到最合適、最高效的超聲輔助條件，在此基礎上，加入雙水相萃取技術，探究萃取效果最佳的雙水相系統組成，以求達到更高的提取率和回收率，為相關酶的提取純化、酶學性質的研究提供便利，同時也為鮑魚內臟的開發利用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

皺紋盤鮑內臟：廈門大學海洋與地球學院提供，-20℃下冷凍儲藏待用；對硝基苯基-β-D-葡萄糖苷（p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside，p-NPG）：北京索萊寶科技有限公司；對硝基苯酚、碳酸鈉、磷酸氫二鈉、檸檬酸、乙酸、乙酸鈉、氫氧化鈉（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）600、1 000、1 500、2 000、4 000、6 000：上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設備

高速組織搗碎機（A25乳化機）：：上海歐河；Scientz-ⅡD超聲波細胞破碎機：寧波新芝生物科技有限公司；3-18K高速冷凍離心機：德國sigma；AF100制冰機：意大利斯科茨曼；Epoch 2酶標儀：BioTek Instrum ents，Inc.。

1.3 超聲波輔助提取的試驗方法

1.3.1 鮑魚內臟的預處理

取一定質量的鮑魚內臟，以1∶4的質量比加入預冷的乙酸-乙酸鈉緩沖液（0.1 mol/L，pH=4.5），在冰浴中用組織搗碎機勻漿后待用[5]。

1.3.2 超聲輔助粗酶液的提取

將上述預處理液等量分裝至小燒杯中，放入超聲波破碎機中，采用冰浴冷卻法，一次超聲時間5 s～10 s，間隔時間5s～10 s，處理一定時間后取出，放置于冰浴中浸提一段時間，用高速冷凍離心機離心（10 000 r/min，4℃，15 min），取上清液。

1.3.3 酶活力的測定

酶活定義：一定條件下，1 mL酶液在1 min內水解p-NPG 產生 1 μmol對硝基苯酚（p-nitrophenol）定義為一個酶活力單位（U）。采用p-NPG比色法，在403 nm處的吸光值來測定β-葡萄糖苷酶的酶活力大小[9]。計算公式如下：

式中：U為β-葡萄糖苷酶酶活性，U/mL；K為曲線斜率；A為403 nm處的平均吸光度；為對硝基苯酚的量，μmol；4 為反應體系的總體積，mL；10 為反應時間，min；0.1為加入的酶量，mL；N為稀釋倍數。

1.3.4 超聲輔助鮑魚內臟粗酶液提取工藝的單因素試驗

以β-葡萄糖苷酶酶活力為指標，探究超聲波輔助處理鮑魚內臟對β-葡萄糖苷酶提取的影響，分別考察以下4個因素：超聲的預處理液體積、超聲波功率、超聲時間、超聲后浸提時間。

1.3.5 超聲輔助鮑魚內臟β-葡萄糖苷酶提取工藝的正交試驗

在單因素試驗的基礎上，選取影響試驗的3個主要因素：超聲波功率、超聲總時間、超聲后浸提時間作為考察因素，在各因素選取3個最佳的水平條件，采用L9（34）正交試驗表進行設計，做三因素三水平正交試驗，以確定β-葡萄糖苷酶超聲輔助提取的最佳工藝條件。正交表設計見表1。

1.4 雙水相技術萃取粗酶液中β-葡萄糖苷酶

1.4.1 PEG/（NH4）2SO4雙水相體系相圖的制作

在室溫下，將 6 種分子量的 PEG（600、1 000、1 500、2 000、4 000、6 000）分別配置成一定質量比的溶液待用。準確稱取一定量某一分子量的PEG溶液，加入試管中置于天平上，然后逐滴加入一定質量分數的（NH4）2SO4溶液，充分混合，直至出現渾濁為止，靜置或離心后能分離成相，記錄加入的（NH4）2SO4溶液的質量，從而計算出PEG、（NH4）2SO4和水在體系中的質量分數。

表1 超聲輔助提取β-葡萄糖苷酶正交試驗因素水平Table 1 Orthogonal test of the ultrasonic assisted β-glucosidase extraction factors and their levels

1.4.2 β-葡萄糖苷酶雙水相萃取

體系總質量固定為10 g，按上述成相條件，準確稱取一定量的PEG溶液和（NH4）2SO4溶液于干燥的試管中，加入1 mL粗酶液，混勻后3 000 r/min低溫離心3 min，記錄上下兩相的體積比，分別測定上下兩相的酶活。

1.4.3 雙水相萃取法中各參數的計算[10]

相比R=下相體積/上相體積；分配系數K=下相酶活/上相酶活；萃取率Y/%=（R×K）/（1+R×K）×100

2 結果與討論

2.1 對硝基苯酚標準曲線

對硝基苯酚標準曲線見圖1。

圖1 對硝基苯酚標準曲線Fig.1 p-Nitrophenol standard curve

如圖 1，回歸方程為 y=16.115x+0.0243，R2=0.999 9，斜率K=16.115。

2.2 鮑魚內臟β-葡萄糖苷酶超聲輔助提取工藝的單因素試驗

2.2.1 超聲的預處理液體積對酶活的影響

在超聲功率為240 W，超聲時間為15 min，超聲后冰浴浸提1 h的條件下，測定不同體積的預處理液進行超聲波處理對其酶活力的影響，結果見圖2。

圖2 超聲的預處理液體積對酶活的影響Fig.2 The effect of ultrasonic pretreatment liquid volume on enzyme activity

由圖2可知，根據預處理液體積的遞增，酶活力呈現先增大后減少的趨勢，當預處理液量過少時，超聲發熱過快導致酶活大量損失；而當預處理液量過大時，破碎率下降，導致目標酶濃度降低，總酶活降低。因此，選擇適當的預處理液體積進行試驗才能較客觀明顯的反映出不同的超聲因素和條件下酶活的變化，因此選擇10 mL的預處理液進行后續的相關試驗較為合適。

2.2.2 不同超聲波功率對酶活的影響

在預處理液體積為10 mL，超聲時間為20 min，超聲后冰浴浸提1 h的條件下，測定不同超聲功率對粗酶液酶活力的影響，結果見圖3。

圖3 超聲波功率對酶活的影響Fig.3 The effect of ultrasonic power on enzyme activity

由圖3可知，當超聲功率小于180 W時，隨著功率的增加，細胞破碎效果越好，目標酶的酶活力呈逐漸增大的趨勢；當超聲功率大于180 W后，酶活力則隨著功率的增大呈逐漸下降的趨勢。該結果產生可能是由于10 mL體積的預處理液在超聲功率在180 W附近時，細胞破碎率較高，且能保持較好的酶活性，而隨著功率的不斷增加，破碎率增大的同時，破碎時產生的熱量導致更多的酶變性失活，且變性速度大于破碎釋放目標酶的速度。所以處理10 mL預處理液時，超聲功率在180 W時是較適宜條件。

2.2.3 不同超聲時間對酶活的影響

在預處理液體積為10 mL，超聲功率為180 W，超聲后冰浴浸提1 h的條件下，測定不同超聲時間對粗酶液酶活力的影響結果見圖4。

圖4 超聲時間對酶活的影響Fig.4 The effect of ultrasonic time on enzyme activity

由圖4可知，當超聲時間少于20 min時，酶活隨著超聲時間的增加而增大；當超過20 min后，酶活隨著時間的增加而呈下降趨勢。該結果產生的原因可能是超聲時間過短時（少于20 min）細胞破碎率較低，目標酶釋放量隨著時間增加而增加；當超聲時間超過20 min后，超聲引起的發熱導致目標酶開始大量變性失活導致酶活不斷喪失。所以選擇超聲處理時間為20 min為較最適宜條件。

2.2.4 超聲后的浸提時間對酶活的影響

在預處理液為10 mL，超聲功率為180 W，超聲處理時間為20 min的條件處理后，考察浸提時間的長短對粗酶液酶活的影響結果見圖5。

圖5 超聲后浸提時間對酶活的影響Fig.5 The effect of extraction time on enzyme activity

由圖5可以看出，隨著浸提時間的增加，目標酶活呈現先增大后減小的趨勢。在浸提時間為3 h時，酶活力相對較高。因此超聲處理后浸提時間為3 h為較適宜條件。

2.3 鮑魚內臟β-葡萄糖苷酶超聲輔助提取工藝的正交試驗

試驗結果如表2所示。方差分析見表3。

表2 超聲輔助提取β-葡萄糖苷酶正交試驗結果Table 2 The result on the orthogonal test of the ultrasonic assisted β-glucosidase extraction

表3 正交試驗方差分析表Table 3 Analysis of variance of orthogonal test

根據極差R值可見，RA＞RB＞RC，所以超聲波輔助提取鮑魚內臟β-葡萄糖苷酶的影響因素主次順序為：超聲頻率＞超聲時間＞超聲后浸提時間。即超聲頻率影響最大，其次是超聲的時間，超聲后浸提時間則影響較小。

試驗指標的影響規律和趨勢，由圖6所示。

由表2的極差分析結果可以看出，在超聲輔助鮑魚內臟β-葡萄糖苷酶的提取過程中，影響目標酶酶活的因素按影響大小排序依次為A＞B＞C，即超聲功率＞超聲時間＞超聲后浸提時間。由表3的方差分析可以看出，其中，超聲功率對目標酶的提取具有顯著性影響，超聲時間對其影響并不顯著，而超聲后浸提時間可視為誤差所致，可不作為影響因素。

由表2及圖6可以得出最佳的條件水平組合為A2B3C3，即當超聲功率為180 W，超聲時間為20 min，超聲后浸提時間為3 h時為最佳工藝條件；但根據上述極差結果以及提取過程中各類成本的綜合考慮，可將浸提時間縮短至1 h作為最佳條件。

圖6 因素與指標趨勢圖Fig.6 Factors and index trend chart

2.4 驗證試驗結果

由上述結果可知，正交試驗結果與單因素試驗結果一致，但根據方差分析及綜合成本考慮，縮短浸提時間至1 h進行驗證試驗，即超聲功率為180 W，超聲時間為20 min，超聲后浸提時間為h；與最佳工藝組合（超聲功率為180 W，超聲時間為20 min，超聲后浸提時間為3 h）進行比較，結果如表4所示。

表4 最優提取工藝驗證試驗結果Table 4 The optimal extraction process validation test results

表4結果可見，超聲后浸提1 h的平均酶活基本與浸提3 h的平均酶活沒有顯著區別，但超聲后浸提1 h能大大縮短時間和材料成本，故可作為最佳條件。

2.5 雙水相體系中各因素對粗酶液中β-葡萄糖苷酶的萃取效果的影響

2.5.1 雙水相體系相圖

圖7是不同分子量的PEG與（NH4）2SO4的雙水相相圖，曲線上的點為臨界點，曲線下方不分相，上方為兩相區。PEG在上相富集，下相則為（NH4）2SO4。

圖7 PEG/（NH4）2SO4雙水相體系相圖Fig.7PEG/（NH4）2SO4aqueous two-phase system phase diagram

從圖7中可以看出，當（NH4）2SO4質量一定時，PEG分子量越大越容易形成雙水相體系；當PEG分子量一定時，（NH4）2SO4過低時難以成相，過高時則易飽和難以溶解，所以在選擇PEG分子量、質量分數和（NH4）2SO4需考慮三者的相互關系[11]。

2.5.2 PEG分子量對萃取的影響

根據相圖，固定（NH4）2SO4的質量分數為16%，選擇不同分子量的 PEG（600、1 000、1 500、2 000、4 000、6 000），并將其質量分數也固定為16%，組成雙水相體系，考察相關各項參數的變化情況，結果如表5所示。

表5 PEG分子量對β-葡萄糖苷酶萃取的影響Table 5 The effect of the molecular weight of PEG on βglucosidase extraction

試驗發現，β-葡萄糖苷酶的分配系數足夠大，第一次萃取就能大量富集分配至下相（NH4）2SO4相，而雜蛋白和細胞碎片都停留在上相PEG相，有較好的分配效果。由表5可知，當PEG分子量較小或較大時，分配系數K和萃取率Y均較小；當PEG分子量為1 000時，分配系數K和萃取率Y均最大。這種現象出現的原因是隨著PEG分子量增加，疏水性增大，成相時分配的水分就越少，上相體積減小，下相體積增大；此雙水相體系中，當PEG分子量較小時，β-葡萄糖苷酶能較多的富集在下相，即（NH4）2SO4鹽相，且能保持較高酶活力，但隨著PEG分子量增大，β-葡萄糖苷酶會逐漸向上相富集，但由于上相雜蛋白、細胞碎片等雜質過多，加上PEG疏水性增大，最終可能導致酶活大量損失，且難以與其他雜質分離，所以分配系數和回收率逐漸減小；但當PEG分子量過小時（600），該體系萃取效果不佳，雜質與目標酶并未有明顯分離，所以PEG分子量為1 000時，分配系數最大，下相對目標酶的萃取率最高。

2.5.3 PEG1000質量分數對萃取的影響

固定（NH4）2SO4的質量分數為16%，考察不同質量分數的PEG1000對β-葡萄糖苷酶萃取的影響，結果如表6所示。

表6 PEG1000質量分數對β-葡萄糖苷酶萃取的影響Table 6 The effect of the mass fraction of PEG1000 on βglucosidase extraction

根據表6結果表明，體系中PEG1000的質量分數為10%時萃取效果最好。當PEG質量分數小于10%時體系不成相，隨著PEG質量分數的增加，兩相體積比逐漸減小，分配系數和萃取率也隨之下降。所以選擇PEG1000的質量分數為10%萃取效果最佳。

2.5.4 （NH4）2SO4質量分數對萃取的影響

根據上述結果，固定PEG1000的質量分數為10%，考察不同質量分數的（NH4）2SO4對β-葡萄糖苷酶萃取效果的影響。結果如表7所示。

表7 （NH4）2SO4質量分數對β-葡萄糖苷酶萃取的影響Table 7 The effect of the mass fraction of（NH4）2SO4on βglucosidase extraction

根據表7的結果可以看出，當（NH4）2SO4的質量分數小于16%時，體系不成相；隨著硫酸銨質量分數逐漸增大，下相體積增大，分配系數逐漸減小，萃取率也呈現明顯下降趨勢，這是因為硫酸銨屬于強電解質，濃度過高時會中和蛋白質表面電荷，破壞表面的水化膜，不利于目標酶的提取。所以選擇質量分數為16%的（NH4）2SO4最為合適。

2.5.5 雙水相體系的pH值對萃取的影響

根據上述結果，確定雙水相體系組成為PEG1000質量分數為10%，（NH4）2SO4質量分數為16%，考察體系的pH值對萃取效果的影響，由于（NH4）2SO4在堿性條件下易水解，從而破壞雙水相的穩定性，所以pH值選擇的考察范圍為3～7之間。結果如圖7所示。

圖7 pH值對β-葡萄糖苷酶萃取的影響Fig.7 The effect of pH on β-glucosidase extraction

該雙水相體系的pH值由（NH4）2SO4決定，其顯弱酸性，使該體系形成的自然pH值為5。由圖7可以看出，隨著pH值逐漸增大，其分配系數和萃取率呈現先增大后降低的趨勢，當pH值為5時，β-葡萄糖苷酶的分配系數和萃取率最佳。

3 結論

通過單因素試驗和正交試驗可以確定出一套較為優化的超聲輔助提取鮑魚內臟中β-葡萄糖苷酶的工藝條件，同時可以得出各因素對酶活的影響大小：超聲功率對酶活有顯著性影響，超聲時間則影響較小，超聲后浸提時間基本不作為影響條件。通過最終的驗證試驗確定超聲輔助鮑魚內臟中β-葡萄糖苷酶提取的最佳工藝條件為：10 mL的鮑魚內臟預處理液，在超聲波功率為180 W，超聲時間為20 min，超聲后浸提時間為1 h。該工藝條件下，能從鮑魚內臟中獲得比常規冷提取方法獲得的活力更大的β-葡萄糖苷酶，且綜合成本較低。

通過考察鮑魚內臟粗酶液中的β-葡萄糖苷酶在PEG/（NH4）2SO4雙水相體系中的分配規律，可以得出對目標酶具有最佳萃取效果的雙水相體系為質量分數為 10%PEG1000，質量分數為 16%的（NH4）2SO4，體系pH值為5（自然）。與傳統方法相比，雙水相萃取不但有較高的提取率，還能進一步去除大量的雜質，達到分離純化的效果，同時還能保持目標酶較高的活性，是一種高效環保又節約的分離提取方法。后續試驗還將對該方法的鹽種類及其他條件進行探究，并通過正交試驗確定最優組合。該研究能為海洋生物下腳料中有效生物活性物質的分離提取提供一種新的方法和思路，對未來的工業化生產打下基礎。