兩種果酒酵母對楊梅果酒發酵及風味的影響

屠夢婷，陳琦，朱婉姣，孫辰茹，金清馨，張有做，許光治

（浙江農林大學農業與食品科學學院，浙江省農產品品質改良技術研究重點實驗室，浙江臨安311300）

楊梅（Myrica rubra Sieb.et Zucc.）是我國南方特色水果，它屬楊梅科喬木植物，果實香氣怡人，呈棕褐色、紫黑色，酸甜適口而廣受歡迎[1]。楊梅果肉中含有豐富的維生素、礦物質元素、膠、纖維素、蛋白質及人體所需的8種必需氨基酸；其鐵、磷、鈣的含量也非常高，約為其它水果含量的十倍以上而且具有食用、藥用雙重價值。由于楊梅果實成熟于高溫多雨的季節，且其果實柔軟多汁，無外果皮包裹，采后呼吸旺盛，因而不耐儲運[2]，導致大量積壓、腐爛。目前，楊梅的深加工產品多見于糖水罐頭、蜜餞、果汁、飲料、果醋等產品[3-4]。

利用新鮮楊梅發酵的果酒，不僅保留楊梅本身的營養物質，而且發酵過程中產生的高級醇、酯、揮發性酸等物質賦予了果酒新的風味。杜晶等[5]對從楊梅樹葉、果園土壤及楊梅自然發酵繆中分離篩選出適宜楊梅果酒發酵的釀造酵母及產香酵母進行菌種鑒定和耐受性研究。李潔瑩等[6]對無醇楊梅果酒的發酵工藝進行優化，得出最適宜的發酵條件，并將無醇楊梅果酒與楊梅汁香氣成分進行對比分析。徐安書等[7]對以葡萄酒活性干酵母為菌種制備楊梅果酒的最佳發酵工藝參數進行了考察。

果酒釀造中，酵母對果酒品質有重要影響。因此，釀酒的過程中選擇一種合適的酵母不僅能提高果酒的口感和風味[8]，還可以提升果酒的品質[9]。楊梅果酒的發酵研究還主要集中于發酵酵母的篩選和工藝優化，關于不同酵母對楊梅果酒品質的影響還研究的較少。目前D254酵母和71B酵母在果酒釀造中運用較廣，這兩種果酒酵母產酒精能力強，酸度較低[10-11]。71B酵母在蓮霧果酒的釀制中發酵速率快，具有較強的降酸功能，且色香味最佳，可作為蓮霧果酒工廠化生產的酵母[12]。在干紅櫻桃酒釀制過程中，7株商業釀酒酵母只有酵母D254發酵效率高，且賦予果酒較佳的感官品質[13]。

本研究分析D254和71B這兩種酵母對楊梅果酒發酵及風味的影響，以期為楊梅果酒的進一步開發及工藝優化提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

楊梅：采于仙居東魁；酵母D254和酵母71B：上海瑞楚生物科技有限公司；無水碳酸鈉、無水亞硫酸鈉、苯酚、3，5-二硝基水楊酸、乙酸鈉、氯化鉀、鹽酸（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

HR-3001B攪拌器：佛山艾詩凱奇電器有限公司；D-37520離心機：美國Sigma-Aldrich；pH-10酸度計：浙江力辰儀器科技有限公司；HWS-150恒溫恒濕箱：上海精宏實驗儀器設備有限公司；GCMS-QP210PLUS氣相色譜-質譜聯用儀、UV-1800紫外分光光度計：日本島津公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 楊梅果酒的制作工藝及流程

楊梅果酒的制作工藝及流程主要參考侍崇娟等[14]方法并略作改動，如下：

楊梅汁處理：取冷凍楊梅解凍，經挑選去除霉變果后清洗，去核榨汁后離心（16 873×g）15 min，分別用0.65 μm和0.45 μm膜過濾，取過濾后楊梅汁30 mL，添加蔗糖至楊梅汁可溶性固形物濃度達到20%，用蘋果酸調節pH值至3.5。

將酵母按質量分數為10%的接種量加至楊梅汁中進行主發酵。在25℃條件下發酵35 d，發酵過程中比較 0、2、4、7、14、21、35 d 這 7 個時間段中不同菌種發酵酒的酵母菌數量、總酸含量、還原糖含量、可溶性固形物含量以及花青素含量。發酵結束后對楊梅果酒取樣進行香氣成分分析。

1.3.2 楊梅果酒理化指標測定

總酸含量測定：參照Wojdylo A等[15]方法測定。可溶性固形物含量測定：采用3，5-二硝基水楊酸比色法[16]測定。酵母細胞數量測定：采用平板計數法測定。花青素含量測定：參照孫曉偉等[17]方法測定。理化指標重復測定3次。

1.3.3 楊梅果酒揮發性香氣成分測定

采用頂空固相萃取法（headspace solid phase microextraction，HS-SPME）對楊梅果酒中的香氣物質進行提現。取3 mL主發酵結束后的酒樣至10 mL頂空瓶中，密封好后將經老化的萃取針插入樣品頂空處，置50℃水浴中，待放穩后推出萃取針頭，頂空萃取30 min后將萃取頭插入氣相色譜-質譜聯用儀（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）進樣口，解吸3 min。

參照馬騰臻等[18]方法并略作修改。

GC-MS條件：

色譜條件：RTX-5MS色譜柱（30 mm×0.25 mm×0.25 mm）；進樣口溫度250℃；升溫程序：色譜柱初溫40℃保持5 min，以6℃/min升至120℃，保持5 min后以5℃/min升至250℃，保持15 min；載氣：高純He；流速：3 mL/min；不分流進樣。

質譜條件：電子電離源；離子源溫度230℃，接口溫度250℃，質量掃描范圍40 m/z～500 m/z。

1.4 數據統計分析

主要采用Excel2007、SPSS19.0等進行數據統計分析處理。

2 結果與分析

2.1 發酵過程中酵母菌數量的動態變化

酵母在發酵過程中數量變化見圖1。

圖1 兩種酵母釀造楊梅果酒酵母數量（濃度）隨發酵時間的變化Fig.1 Changes of yeast number（concentration）in fermented waxberry wine with different fermentation time by two kinds of yeast

酵母在發酵過程中數量變化如圖1所示，酵母71B的數量在第2天快速增加至第7天達到最高值為1.43×108個/mL后有個緩慢減少的過程，最后基本達到平臺期；而酵母D254在第2天快速增加至第7天后仍緩慢上升至第15天達到最高值為1.30×108個/mL但仍不及71B，到第15天之后，酵母D254生長基本至停滯狀態，微生物數量變化很小。

2.2 楊梅果酒發酵過程中理化指標變化

在發酵過程中理化指標變化見圖2。

圖2 兩種酵母釀造楊梅果酒理化指標的變化Fig.2 Changes of physical and chemical indexes in fermented waxberry wine with different fermentation time by two kinds of yeast

由圖2可知，隨著發酵時間的增長，總酸含量呈先上升至最大值后稍微下降至穩定趨勢，還原糖含量、可溶性固形物含量和花青素含量均呈先下降后穩定的趨勢，pH值控制在3.3～3.5且無明顯變化，酵母菌比細菌耐酸，低pH值能抑制雜菌的生長，低pH值和高含量的有機酸有助于穩定顏色和口感[19]，提高楊梅果酒的質量。總酸度在楊梅果酒釀造中是一個重要的理化指標，它直接影響楊梅的顏色、口感和風味。酵母D254在楊梅果酒的發酵過程中總酸度迅速上升至第4天達到最大值為10.91g/L，隨后下降至平臺期。酵母71B在楊梅果酒的發酵過程中總酸度迅速上升到第4天后持續緩慢上升至第14天達到最大值為10.77 g/L，隨后緩慢下降至平臺期。與酵母D254相比，發酵結束后71B制得的果酒總酸含量明顯高于酵母D254。另外，兩種酵母在發酵釀制楊梅果酒過程中的可溶性固形物含量均持續下降至第14天后呈穩定趨勢，整體變化趨勢相似且基本無差異，相對而言71B含量較高。兩種酵母在發酵釀制楊梅果酒過程中還原糖含量有明顯的降低過程，整體變化趨勢與可溶性固形物含量變化趨勢相似且基本無差異。整個發酵過程中，楊梅果酒中的花青素（矢車菊花素-3-葡萄糖苷）含量呈遞減趨勢。原汁中花青素的含量為（0.501±0.013）g/L，酵母D254在楊梅果酒的發酵過程中花青素含量在前14天持續下降，第14天后花青素含量顯著減少（P＜0.05），在第21天趨于穩定。酵母71B在楊梅果酒的發酵過程中花青素含量在前7天顯著減少（P＜0.05）后持續緩慢下降，在第21天趨于穩定。釀酒過程結束時，由D254酵母發酵的楊梅果酒花青素含量為（0.201±0.009 7）g/L；由71B酵母發酵的楊梅果酒花青素含量為（0.231±0.016）g/L。

2.3 兩種酵母釀造楊梅果酒香氣成分的比較分析

發酵結束后不同接種發酵果酒中香氣成分見圖3和圖4。

圖3 果酒酵母D254發酵楊梅果酒香氣成分GC/MS圖譜Fig.3 Total ion current chromatogram of the aromatic components in waxberry wine fermented with yeast D254

圖4 酵母71B發酵楊梅果酒香氣成分GC/MS圖譜Fig.4 Total ion current chromatogram of the aromatic components in bayberry wine fermented with wine yeast 71B

果酒的香氣成分是水果（品種香氣）、果酒發酵過程形成的次級代謝產物（發酵香味）和陳釀階段形成的揮發性化合物的獨特混合[20]。由于特定的酵母菌株可能有助于楊梅果酒的特征風味，并且還可以在發酵期間產生不同量的芳族化合物[21]，而這些芳香活性化合物的產生在不同酵母菌株之間存在高度的差異，因此，精心挑選具有最佳芳香族特征的菌株對于高質量的最終產品而言是至關重要的[22]。對2個圖中任一峰面積相對強度不低于0.8%的共28種成分進行了分析，其中檢測到D254發酵楊梅果酒22種香氣成分、71B發酵楊梅果酒24種。兩批楊梅果酒香氣成分的比較分析及統計結果如表1所示。

表1 2種酵母發酵的楊梅果酒主要香氣成分Table 1 Aroma components in waxberry wines fermented with two yeasts

通過GC-MS初步鑒定兩種酵母發酵的楊梅果酒酒樣中的28種香氣成分（見表1），這些成分主要是醇類3種、酸類2種、酯類15種、醛酮類2種、烷烴、烯烴類3種、酚醚類1種以及其他類2種。

在酵母D254釀造的楊梅果酒中，共檢測出22種香氣成分，占總峰面積的97.17%。其中，醇類71.64%、酸類9.02%、酯類10.34%、醛酮類0.32%以及烷烴、烯烴類0.23%。其主要香氣成分為3-甲基-1-丁醇、乙酸、甲氧基苯基肟和十六酸乙酯，相對含量分別為70.77%、7.96%、4.29%和3.43%。

在酵母71B釀造的楊梅果酒中，共檢測出24種香氣成分，占總峰面積的98.19%。其中，醇類72.49%、酸類4.05%、酯類16.22%以及烷烴、烯烴類1.11%。其主要香氣成分為3-甲基-1-丁醇、苯乙醇、十六酸乙酯、甲氧基苯基肟和2，3-丁二醇，相對含量分別為62.71%、6.61%、5.22%、4.02%和3.17%。

續表1 2種酵母發酵的楊梅果酒主要香氣成分Continue table 1 Aroma components in waxberry wines fermented with two yeasts

2.4 兩種酵母發酵的楊梅果酒中主要呈香物質分類比較

兩種楊梅果酒中香氣成分類型及相對含量見圖5。

圖5 兩種酵母發酵的楊梅果酒香氣成分類型及相對含量Fig.5 Chemical classes and contents of aroma components in waxberry wine fermented with two yeasts

楊梅果酒中香氣成分按化合物結構分為醇類，酸類，酯類，醛、酮類，烷烴，烯烴類，酚、醚類和其他類，各類香氣物質的相對含量由圖5可知，楊梅果酒香氣成分中主要以醇類和酯類為主（占80%多）且與以往研究結果類似，說明了在楊梅果酒的釀制中醇類物質和酯類物質是主要的揮發性風味化合物。兩種楊梅果酒中，酯類和酸類物質的相對含量差別較明顯，尤其是酵母71B發酵的楊梅果酒中酯類物質的相對含量相比酵母D254發酵的楊梅果酒高5.88%，這是因為果酒的成分極其豐富，發酵原料、酵母菌種以及發酵工藝操作和發酵條件等各項因素均會影響成品果酒的香氣成分組成[23]。而醇類、醛酮類、烷烯類、醚類以及其他類物質的相對含量差異較小。

2.4.1 醇類香氣物質比較

由圖5可知，醇類物質是果酒中主要的呈香物質。高級醇的總量與3-甲基-1-丁醇的濃度密切相關，3-甲基-1-丁醇的濃度高于每種形式的總醇的60%以上[24]。由表1可知，兩種楊梅果酒中共檢測出3種醇類物質，相同醇類有2種，其中由酵母D254釀制的楊梅果酒中含量較高的只有3-甲基-1-丁醇，而酵母71B釀制的楊梅果酒中含量較高的醇類組分是3-甲基-1-丁醇和苯乙醇，3-甲基-1-丁醇是含量最多的高級醇類物質，是楊梅果酒重要的特征風味化合物。酵母71B釀制的果酒中含有的苯乙醇具有玫瑰花香[25]且從圖5可以看出，酵母71B發酵的楊梅果酒中醇類物質的含量最高，這就說明酵母71B總體產醇能力要優于酵母D254。

2.4.2 酸類香氣物質比較

由表1可知，酵母D254和酵母71B發酵的楊梅果酒中均檢測出2種酸類分別是乙酸和辛酸，相對含量分別為7.96%，2.87%和1.06%，1.18%。兩種酵母釀制的楊梅果酒酸類物質含量相比較明顯，如酵母D254釀制的果酒中乙酸的相對含量達到7.96%。

2.4.3 酯類香氣物質比較

由圖5可知，兩種楊梅果酒中共檢測出酯類物質15種，其中11種酯類物質是兩種共有的。由表1可知，酵母71B發酵的楊梅果酒種酯類組分的相對含量最高達到16.22%，說明酵母71B總體產酯能力要優于酵母D254。相對含量較高的幾種酯類物質如十六酸乙酯、癸酸乙酯、9-十六碳烯酸乙酯、辛酸乙酯和十八酸乙酯為兩種果酒所共有，但相對含量差異較大，尤其是酵母71B發酵果酒中十六酸乙酯和癸酸乙酯的相對含量遠高于酵母D254。酯類香氣主要是酵母菌活動以及在漫長的陳釀過程中產生，大多數都具有明顯的花香味，如十六酸乙酯呈微弱蠟香、果爵和奶油香氣；癸酸乙酯具有葡萄的香氣[26]；辛酸乙酯具有白蘭地酒香味等。

2.4.4 醛、酮類香氣物質比較

由表1可知只有酵母D254檢測出醛、酮類物質2種，而71B未檢測到，這可能是受菌株本身的限制，如在發酵過程中不能產生這種成分，也可能是受檢測方法的限制。雖然果酒釀制中醛、酮類物質的存在會對果酒香氣有一定的貢獻，如癸醛存在于柑橘、檸檬、草莓等中，具有甜香、柑橘香、蠟香和花香，但其中D254含有少量的2，5-二（三甲硅氧基）苯甲醛對人體有害的成分，而酵母71B不含有對人體有害的成分。

2.4.5 其他類香氣物質比較

兩種酵母發酵的楊梅果酒中檢測出3種烷烴、烯烴類物質，1種酚、醚類，3種其他類物質，其中兩種果酒共有的烷烴、烯烴類物質只有一種石竹烯（見表1）。有對東魁等品種楊梅的特征香氣成分的研究表明，石竹烯等半萜烯類成分是楊梅的主要芳香物質[27]，然而由發酵制備的楊梅果酒、果醋中石竹烯含量卻很低[28]，本文的結果也是如此，含量較低可能是由于發酵前的加熱滅菌、酵母代謝及發酵散逸造成[28]。由表1結果可知，71B楊梅果酒石竹烯含量最高為0.31%，即酵母71B發酵制備楊梅果酒中含有的石竹烯等半萜烯類成分的損失相對小。在酵母D254和酵母71B發酵的楊梅果酒中均檢測出甲氧基苯基肟，且相對含量較高，相對含量分別達到4.29%和4.02%，說明甲氧基苯基肟為楊梅果酒中主要風味物質之一。

3 結論

本文對D254和71B這兩種酵母菌進行發酵試驗制備楊梅果酒。測定指標的變化趨勢表明，71B酵母釀酒過程中，生長狀況佳。采用GC-MS分析兩種酵母發酵的楊梅果酒香氣成分，兩種酵母發酵的酒樣中共檢測出香氣28種，其中在酵母D254發酵的楊梅果酒中共檢測出香氣成分22種，在酵母71B發酵的楊梅果酒中共檢測出香氣成分24種。結果表明，與酵母D254相比，酵母71B發酵的楊梅酒中含有苯乙醇、十六酸乙酯和癸酸乙酯等具有特殊香氣物質且楊梅中主要芳香物質石竹烯等半萜烯類成分損失較小，香氣濃郁，是非常適宜傳統工藝下釀制楊梅果酒的酵母。以此可為楊梅的進一步深加工及釀酒工藝優化提供參考。