鮑魚內臟酶解液抗氧化能力及脫腥工藝研究

梁杰，趙曉旭，楊志強，汪少蕓

（1.莆田學院環境與生物工程學院，福建省新型污染物生態毒理效應與控制重點實驗室，福建莆田351100；2.福州大學生物科學與工程學院，福建福州350108）

海洋生物體內存在許多珍貴的天然生物活性物質[1]，因生活環境與陸地環境的巨大差異（低溫、高壓、高鹽度、避光、低氧）而具有結構新穎、功能特殊的生物學特性[2-3]。各國科學研究者已經從海洋動物、植物、微生物中分離出各種生物活性物質[4-9]，其中一些已經通過臨床驗證并已成功上市，深受廣大消費者喜愛和好評。鮑魚（abalone）貴為“海珍之冠”，是一種優質的動物蛋白，研究表明，其內臟和肌肉中生物活性成分相似，含有豐富的蛋白質、氨基酸、牛磺酸、多糖等營養元素，具有抗氧化、抗腫瘤、調節免疫力及促進皮膚膠原蛋白再生、維持生理代謝等保健功能，鮑魚內臟（性腺）酶解物中氨基酸種類齊全，且具有良好的抗氧化能力，具有較高的研發價值[10]。由于海產品的生存環境，使其具有濃重的腥臭味，而這種令人厭惡的特征，影響水產蛋白酶解產物的開發應用。酶解液中存在的苦腥味主要是由于酶解過程產生含疏水基團的短肽和疏水性氨基酸，目前脫腥脫臭的方法主要為：物理吸附法、β-環糊精包埋法（β-Cyclodextrins，CDs）、酶法、微生物法、抗氧化劑法、萃取法、掩蓋法、微膠囊法、蒸氣脫腥法、酸堿處理法、高壓脈沖電場法等[11-12]。

本文在前期試驗基礎上制備得到鮑魚內臟粗蛋白，以抗氧化能力和水解度為指標通過單因素和正交試驗確定最佳酶解條件，得到具有較強抗氧化能力的酶解液；以食品級活性炭粉末為吸附劑，以蛋白質回收率和感官評價為指標，對酶解液進行脫腥去苦工藝優化（包括活性炭添加量、吸附時間、溫度等因素），確定最佳工藝參數。將水產品加工下腳料變廢為寶，制備抗氧化肽[13]，為提高鮑魚產品附加值和資源利用率提供了新思路，為推動海產品精深加工及開發相關保健品提供試驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗原料

鮑魚內臟：福建莆田城南市場。

1.1.2 試驗試劑

木瓜蛋白酶：諾維信（中國）生物技術有限公司；活性炭：萊陽市康德化工有限公司；其它化學試劑：國產分析純；試驗過程用水：均為去離子水。

1.2 儀器與設備

FD-1B-55型冷凍干燥機：北京博醫康實驗儀器公司；UV2550紫外/可見分光光度計：日本島津公司；DHG-9030A電熱恒溫鼓風干燥箱：上海精宏公司；MDF-U333型超低溫冰箱：日本三洋公司；PB-10型精密數顯酸度計：賽多利斯公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 酶解工藝

1.3.1.1 酶解液的制備

鮑魚粗蛋白粉（冷藏）→加水攪拌至完全溶解→最佳酶解條件，充分酶解→100℃下滅酶10 min→靜置冷卻后10 000 r/min速率離心分離10 min，取上清液→酶解液，待測。

1.3.1.2 水解度的測定

參照文獻[14-15]通過甲醛滴定法測定。

1.3.1.3 DPPH自由基清除率的測定

參照文獻[16]的方法測定DPPH自由基清除率。

1.3.1.4 單因素試驗

參考文獻[17]并在前期大量探索試驗的基礎上，以水解度和自由基清除率為評價指標，分別考察酶/底物（[E]/[S]）（400、600、800、1 000、1 200、1 400、1 600、1 800 U/g）、底物濃度（1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%）、酶解時間（1.0、1.5、2.0、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 h）、酶解溫度（30、35、40、45、50、55、60、65、70 ℃）、pH 值（分別調節為 4、5、6、7、8、9、10）等條件對酶解效果的影響，確定各因素的適宜范圍。

1.3.1.5 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，綜合考慮各因素之間的互相影響，選擇酶/底物（U/g）、酶解溫度（℃）、底物濃度（%）、pH值4個因素3個水平進行優化，做四因素三水平L9（34）的正交試驗分析。因素水平表見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factor levels table of orthogonal test

1.3.2 脫腥除臭工藝

將食品級的活性炭粉末按一定比例加入酶解液中，充分攪拌，調節pH值，將其置于一定溫度水浴搖床中，吸附反應一定時間，經4 000 r/min離心10 min，測定上清液中蛋白質回收率并進行感官評定。在前期預試驗的基礎上并參考文獻[18]，以蛋白質回收率和感官評定腥味值為指標，通過活性炭添加量（0.25%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）、吸附時間（0、20、40、60、80、100、120min）、吸附溫度（10、20、30、40、50、60℃）等單因素進行試驗，在此基礎上進行正交試驗，優化酶解液的脫腥脫臭工藝參數。因素水平表見表2。

表2 正交因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal test

1.3.2.1 蛋白質回收率的測定

用凱氏定氮法分別測定酶解液經活性炭吸附前和吸附后的蛋白質含量，計算蛋白質回收率。

式中：Pro1為脫腥液的蛋白質含量，mg；Pro2為酶解液的蛋白質含量，mg。

1.3.2.2 腥味感官評定方法

人類天生具有靈敏的嗅覺，能夠察覺分析儀器無法檢測的低濃度氣味物質的存在，例如能覺察出在1 m3空氣中有4×10-5mg甲基硫醇，儀器卻無法檢測到[19]。在食品風味研究中，感官評定是最簡單、直觀的方法，感官評分為最常用的方法。腥味感官評定由預先培訓的10名固定的感官評定人員組成，采用先聞后嘗的方式，為不影響評定結果，測評過程中不允許交流和討論。分別對試驗樣品的腥味、苦味、外觀顏色進行綜合測評，以去離子水為對照（分值為0分），評分標準如表3 所示[19-20]。

表3 評分標準Table 3 Standards for sensory evaluation

2 結果與分析

2.1 最佳酶解條件的確定

多肽的抗氧化能力與水解度、分子量分布、氨基酸組成等因素密切關聯，研究酶解參數條件，如底物濃度、酶解溫度、酶/底物、酶解時間、pH值等因素，對于獲取具有較強抗氧化能力的活性肽至關重要[21]。前期試驗提取得到鮑魚內臟粗蛋白凍干粉。在前期大量試驗摸索的基礎上，以水解度和抗氧化能力為指標，選用木瓜蛋白酶為工具酶；以水解度（DH）和DPPH自由基清除率為評價指標，分別考察底物濃度、酶解溫度、酶/底物、酶解時間、pH值對木瓜蛋白酶酶解效果的影響。

2.1.1 酶解條件單因素試驗

酶/底物、底物濃度對酶解效果及DPPH自由基清除率的影響見圖1所示，酶解時間、酶解溫度、pH值對酶解效果及DPPH自由基清除率的影響如圖2所示。

圖1 酶/底物（A）、底物濃度（B）對酶解效果及DPPH自由基清除率的影響Fig.1 Effect of[E]/[S]（A），substance concentration（B）on eymohydrolysis and DPPH racial clearancing activity

2.1.1.1 酶/底物對鮑魚源抗氧化肽酶解效果的影響

圖2 酶解時間（A）、酶解溫度（B）、pH值（C）對酶解效果及DPPH自由基清除率的影響Fig.2 Effect of time（A），temperature（B），pH value（C）on eymohydrolysis and DPPH racial clearancing activity

由圖1（A）可知，隨著酶/底物的增加，酶解液水解度出現先增加后減小的趨勢，在酶/底物為400 U/g～1 200 U/g時，酶解液水解度不斷提高，在酶/底物即[E]/[S]為 1 200 U/g時水解度達到最大值（16.55±0.32）%；這是由于蛋白質濃度一定的情況下，體系內酶解效率隨著酶添加量的不斷增加而提高，酶解效率越高，則水解度也就相應的越大，當水解反應進行到一定程度，底物被飽和，酶的數量出現過剩的情況，此時水解速率幾乎保持穩定的狀態。一般認為，[E]＜＜[S]時，酶反應速率與底物濃度呈正比關系，反應到一定時間之后隨著[E]/[S]增加，水解度變化不明顯。DPPH自由基清除率隨著酶/底物增加不斷增大，當酶/底物達到1 200 U/g時DPPH自由基清除率達到最大值（79.76±0.97）%，即酶解液抗氧化活力達到最大值；之后酶/底物繼續增加到1 800 U/g，DPPH自由基清除率出現下降的趨勢，該現象的產生可能是由于隨著酶解反應的進行，越來越多的蛋白被水解成小片段肽，DPPH自由基清除率不斷上升，而當水解達到一定程度時，出現過度水解反應導致部分具有抗氧化活性的肽段被酶解而失去抗氧化能力，且蛋白酶本身也是一種蛋白質，自身發生酶促反應干擾反應體系；這與姚翔的研究相一致，他通過中性蛋白酶和氨肽酶酶解紫菜蛋白，酶解產物的DPPH自由基清除率也隨著加酶量的增加先增大后降低[22]。綜上所述，以抗氧化能力為參考指標，兼顧生產成本和水解度的因素，選擇酶/底物為1 200 U/g為最佳水平。

2.1.1.2 底物濃度對鮑魚源抗氧化肽酶解效果的影響

結果如圖1（B）所示，隨著底物濃度的增大水解度出現先升高后降低的趨勢，在底物濃度為6%時達到最大為（14.41±0.56）%。這是因為底物濃度較小時底物蛋白過于分散，影響酶促反應的進行，使得酶解反應效率較低，因此水解度在反應開始階段呈現較低的情況；隨著底物濃度不斷增加，加快體系中生物大分子如蛋白質和酶在水中的自由擴散，促進酶促反應的有效進行，水解度高；底物濃度過大，反應體系的黏度液相應變大，體系流動性差，造成底物蛋白與蛋白酶活性部位無法得到有效結合，使得底物蛋白與木瓜蛋白酶的接觸不夠完全，抑制酶解反應的進行[23]。當底物濃度為1%～6%時，酶解液清除DPPH自由基的能力也不斷升高，在底物濃度為6%時清除率達到最大值（84.15±0.34）%，這是因為底物濃度越大，參加反應的底物蛋白也越多，產生的抗氧化肽段比例也越高，所以抗氧化能力呈現上升的趨勢；當底物濃度達到一定值時，酶解反應能夠有效利用的酶均結合在反應位點上，沒有多余的酶與底物蛋白相結合，此時即使不斷增加底物濃度，酶解液的抗氧化能力仍然維持在一定水平不再升高。劉丹用Alcalase堿性蛋白酶制備大豆抗氧化肽，底物濃度添加量與自由基清除率的關系也呈現一樣的變化趨勢[24]。綜上所述，選擇底物濃度6%為最佳用量。

2.1.1.3 酶解時間對鮑魚源抗氧化肽酶解效果的影響

由圖 2（A）可知，酶解時間為 1.0 h～5.0 h 時，水解度呈現不斷上升的趨勢，在3.5小時后水解度仍然呈上升趨勢但增幅開始減緩，這是因為隨著酶解時間的增加，酶對專一性的肽鍵水解達到飽和，且隨著反應的不斷進行，底物濃度不斷減低，產物濃度不斷累積增加，酶的競爭性抑制趨于穩定[25]。在酶解過程進行到第4小時時，酶解液DPPH自由基清除率達到最大值（83.76±0.31）%，這可能與目的產物抗氧化肽被過度水解，導致具有抗氧化活性的肽段被切割而降低抗氧化能力有關。綜上所述，以DPPH自由基清除率為評價指標，兼顧生產時間成本，選擇酶解時間為4.0 h為最佳酶解時間。

2.1.1.4 酶解溫度對鮑魚源抗氧化肽酶解效果的影響

結果如圖2（B）所示，隨著酶解溫度的升高，酶解液水解度也呈升高的趨勢，而DPPH自由基清除率在溫度達到40℃后則沒有顯著變化。在酶促反應進行過程中，溫度是影響較大的因素之一，溫度升高，反應加快，因而水解度升高，溫度降低，反應速度減慢。由圖2（B）可知，60℃為抗氧化能力最大時的酶解溫度。

2.1.1.5 pH值對鮑魚源抗氧化肽酶解效果的影響

結果如圖2（C）所示，隨著pH值增加酶解液水解度不斷升高，在pH值為8時達到最大值（15.01±0.55）%，pH值繼續增大，即溶液體系開始變為偏堿性時，水解度出現下降。pH值為7是木瓜蛋白酶的最適pH值環境，此時水解度和抗氧化能力都尚未達到最大值。這是因為酶的最適pH值不是酶的特征物理常數，即不是一成不變的固定值，與酶和底物濃度、酶的作用時間、環境中pH值密切相關，酶與底物的結合和催化反應常取決于底物和酶分子的電荷分布，酶活性受pH值影響較為顯著，蛋白質的電荷分布是由氨基酸序列中可解離的側鏈狀態決定，而這又與pH值相關，過酸或過堿都會影響其活性。在pH值為8的條件下，該體系酶促反應的效率最高，酶解液中抗氧化肽所占比例最大，此時DPPH自由基清除率為（85.67±0.92）%。綜上所述，選擇pH值為8酶解的最適pH值。

2.1.2 制備抗氧化肽的正交試驗

分析單因素試驗結果，選取酶/底物（U/g）、底物濃度（%）、pH值、酶解溫度（℃）做四因素三水平L9（34）的正交試驗分析，正交試驗結果見表4，方差分析見表5。

表4 正交試驗結果表Table 4 Orthogonal experiment and results

表5 方差分析表Table 5 Results of variance analysis

由表4中可知，4個因素中，對自由基清除率的影響主次排序為：C＞A＞D＞B，即影響抗氧化能力因素的主次順序為：pH值＞酶/底物＞酶解溫度＞底物濃度。通過正交優化分析得到最優組合為A1B1C3D2，正交表中實際自由基清除率最高的組合為A1B3C3D3，為獲得最佳的抗氧化能力活性肽片段并從實際生產中節約成本的原則出發，選取A1B1C3D2為最佳試驗方案。由表5可知，因素pH值對自由基清除率的影響具有顯著性，酶/底物和底物濃度對自由基清除率的影響不顯著。綜上，本試驗的優化組合為A1B1C3D2，即pH值9，酶/底物1 000 U/g，酶解溫度60℃，底物濃度5%。

2.1.3 最佳條件的驗證

控制反應體系處于最佳條件下，測定該條件下酶解得到抗氧化活性肽其DPPH自由基清除率為（88.14±0.92）%，與正交表4中的結果對比，確為最高，因此該工藝為制備鮑魚抗氧化肽的最佳酶解條件。

2.2 脫腥脫臭工藝的優化

鮑魚內臟蛋白酶解液是具有良好抗氧化能力的多肽片段，該水溶性蛋白水解產物存在著海產品特有的較為濃郁苦腥味。活性炭是一種常見的疏水性吸附劑，本研究采用活性炭為脫腥劑，以蛋白質回收率和感官評定腥味值為參考指標，通過考察脫腥劑用量、吸附pH值、吸附時間、吸附溫度等單因素對脫腥脫臭效果的影響，旨在優化水產品脫腥脫臭的工藝參數，為工業化生產奠定試驗基礎。

2.2.1 單因素試驗

活性炭添加量、pH值對蛋白質回收率和感官指標的影響如圖3所示，溫度、吸附時間對蛋白質回收率和感官指標的影響如圖4所示。

2.2.1.1 活性炭質量分數的影響

圖3 活性炭添加量（A）、pH值（B）對蛋白質回收率和感官指標的影響Fig.3 Activated carbon content（A），pH 值（B）influence on protein recuperation and sensory index

圖4 溫度（A）、吸附時間（B）對蛋白質回收率和感官指標的影響Fig.4 Temperature（A），Adsorption time（B）influence on protein recuperation and sensory index

活性炭質量分數對酶解液脫腥脫臭效果影響如圖3（A）所示，隨著活性炭添加量的增加，感官指標分值隨著活性炭質量分數的增加而降低，表明活性炭去苦腥味效果良好；由于活性炭對蛋白也有一定的吸附能力，造成蛋白質回收率隨著活性炭質量分數的增加而降低。為保證試驗效果，既要腥味物質和色素分子能被活性炭最大限度吸附，又要避免蛋白多肽等活性物質被吸附造成物料損失，以蛋白質回收率兼顧腥味感官值為指標，活性炭添加量為1.0%時，蛋白質回收率可達到（84.34±0.45）%，此時腥味值為4.40，腥苦味相對較小。綜上所述，本試驗選擇活性炭添加量為1.0%為最佳水平，并選取1.0%、1.5%、2.0%為后續正交試驗中活性炭質量分數因素的3個水平。

2.2.1.2 pH值的影響

吸附體系pH值對酶解液脫腥脫臭效果影響如圖3（B）所示，pH值對蛋白質回收率和感官評分值的影響顯著，在酸性條件下，即pH值范圍在2～6時，活性炭對體系的脫腥脫臭效果較為理想，且蛋白質回收率呈遞增的趨勢；當體系pH值從中性緩慢過渡到堿性時，即pH值范圍在7～9時，蛋白質回收率呈緩慢增大的趨勢，但活性炭的脫腥脫臭能力開始減弱，感官評定分值出現增加的情況。為兼顧蛋白質回收率和腥味感官值兩個參考指標，選擇吸附體系pH值6.0為最優水平，該水平下感官評定分值為3.45，此時蛋白質回收率可達（85.45±0.45）%。利用活性炭在體系酸堿性不同的條件下對色素的吸附和解析作用，可以循環利用活性炭[26]。綜上所述，本試驗選擇pH 6.0為最佳水平。

2.2.1.3 吸附溫度的影響

吸附溫度對活性炭脫腥脫臭效果影響如圖4（A）所示，在10℃～40℃時，感官評定分值呈遞減的趨勢，表明升高溫度能夠促進活性炭吸附酶解液中的色素分子，此時蛋白質回收率也呈遞增的趨勢，當溫度為40℃時，蛋白質回收率為（88.13±0.32）%，此時腥味感官值最低，為3.61；當溫度升高到60℃時，蛋白質回收率僅剩（70.25±0.47）%，此時腥味值也呈增大趨勢；綜合考慮，既要腥味物質和色素分子被活性炭吸附，同時要避免蛋白多肽等活性物質被吸附造成物料損失，同時考慮能耗因素，選擇吸附溫度為40℃為最佳水平，并選取30、40、50℃為后續正交試驗中溫度因素的3個水平。

2.2.1.4 吸附時間的影響

如圖4（B）所示，當吸附時間在0～80 min時，蛋白質回收率隨時間延長呈降低趨勢，當時間為80 min～120 min時，活性炭吸附劑的對蛋白質的吸附開始趨于飽和，當時間為120 min時，蛋白質回收率僅剩下（77.44±0.98）%；當吸附時間為 0～60 min時，腥味感官值呈現降低的趨勢，在60 min時腥味感官值達到最低值2.81，時間繼續延長，此時感官腥味值受時間的影響趨于不明顯。綜上所述，考慮時間成本，選擇吸附時間為60 min為最佳水平，并選取40、60、80 min為后續正交試驗中時間因素的3個水平。

2.2.2 活性炭吸附正交試驗結果

分析單因素試驗，選取活性炭質量分數、pH值、吸附溫度3個因素進行L9（34）正交優化試驗。試驗結果及分析分別見表6、表7、表8。

表6 正交試驗設計及結果Table 6 The orthogonal design and results of anthrasorb odor treatment

表7 方差分析表（以蛋白質回收為指標）Table 7 Analysis of variance table（protein recuperation）

對因素C而言，它對感官值的影響最重要，故選因素C的第二水平，即C2；對因素B而言，選第一水平時其蛋白質回收率較低，最高僅為81.65%，而當選第二水平時，蛋白質回收率最高可達88.43%，故選因素B的第二水平，即B2；對因素A而言，它對蛋白質回收率的影響最重要，對感官值的影響次序排第二，當選因素A的第一水平時，蛋白質回收率最高可達88.57%，而選因素A的第二水平時，蛋白質回收率最高僅為83.11%，綜合考慮，因素A選取第一水平為最合適，即A1。

表8 方差分析表（以感官值為指標）Table 8 Analysis of variance table（sense evaluate）

由方差分析表7、8可知，活性炭質量分數對蛋白質回收率影響顯著，吸附溫度對蛋白質回收率的影響不顯著，歸入誤差項；吸附溫度對腥味值的影響極顯著，活性炭質量分數對腥味值的影響較顯著，吸附時間對腥味值的影響不顯著，歸入誤差項。

綜上，本試驗優化后的因素組合為A1B2C2，即食品級粉末活性炭的質量分數為1.0%，吸附時間為60min，吸附溫度為40℃。在該條件下試驗得到的蛋白質回收率為（88.06±0.24）%，腥味值為 2.00。

3 結論

鮑魚內臟蛋白通過木瓜蛋白酶充分酶解，以抗氧化能力和水解度為指標進行單因素和正交試驗得到最佳酶解條件：pH值9，酶/底物1 000 U/g，酶解溫度60℃，底物濃度5%，該條件下酶解得到抗氧化活性肽其DPPH自由基清除率為（88.14±0.92）%，酶解液水解度為（14.12±0.53）%。海產品酶解液本身具有令人厭惡的苦腥味，因此選擇食品級活性炭粉末作為吸附劑進行脫腥脫臭，以蛋白質損失率和感官評定為指標，得到活性炭最佳吸附工藝參數為：活性炭質量分數1.0%，吸附時間60 min，吸附溫度40℃，該條件下得到蛋白質回收率為（88.06±0.24）%，腥味值為2.00，此時酶解液無明顯苦腥味，液體澄清呈淡黃色，感官品質顯著改善。