桑黃菌發酵醬渣生產黃酮和蛋白質的培養基優化

檀鑫榕，陳舒婷，冉早紅，郝夢凡，金紅

（天津農學院農學與資源環境學院，天津300384）

食用菌深層發酵不僅菌絲體生長速度快、營養利用率高，而且在發酵液中還含有相當豐富的初級代謝產物（如蛋白質、多糖）和次級代謝產物（如黃酮、抗菌素等）[1-4]。桑黃（Phellinus igniarius）學名鮑氏層孔菌，屬于擔子菌亞門，層菌綱，多孔菌科的藥用真菌，是目前國際公認的抗腫瘤效果最好的藥用真菌之一[5-7]。現已證明，桑黃含有多種藥理成分，如多糖、黃酮、香豆素等[8-12]，且在發酵過程中也會產生蛋白和黃酮等物質，這些為富含蛋白質和黃酮類物質的新型食品和生物制劑的開發提供了參考。芝麻醬渣作為香油制備過程中的廢棄物，成本低廉，多作為肥料和飼料使用，商品價值低[13]。其富含蛋白質，脂肪和磷等元素，是很好的培養基基質，同時兼顧有碳源和氮源的基質，若將其添加到食用菌發酵培養基中，必將為芝麻醬渣的深度利用開辟新的途徑[14-15]。目前，桑黃在國際市場上供不應求，野生桑黃資源有限，桑黃的人工栽培研究在國內又剛剛起步，所以探索桑黃固體發酵既可以生產特色飼料也可以培養桑黃菌株，有廣闊的市場前景[16-17]。以桑黃菌（Phellinus igniarius，銹革孔菌屬多孔菌科）為材料，將芝麻醬渣以一定比例添加到桑黃菌的深層發酵培養基中，經過發酵利用，測定發酵液中黃酮和可溶性蛋白的含量及菌絲體干重，通過正交試驗和多指標綜合平衡[18-22]。通過查閱文獻，篩選出桑黃菌深層發酵生產黃酮、可溶性蛋白、菌絲體干重三指標均較高的優化培養基配方[23-24]，以期為我國桑黃菌的開發提供參考，為芝麻醬渣的深度利用提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

桑黃菌種：由天津農學院生物技術實驗室提供。芝麻醬渣：天津市紅旗農貿批發市場，80℃烘干，粉碎，過60目篩，備用。

1.2 試劑

葡萄糖、蛋白胨、酵母浸膏、MgSO4、KH2PO4：天津市英博生化試劑有限公司；槲皮素對照品、考馬斯亮藍G-250：鼎國生物技術有限公司，均為國產分析純。

1.3 儀器

BCM-1000A雙人雙面超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；Neofuge 13R型臺式高速冷凍離心機：力康發展有限公司；LDZX-40SCI型立式電熱自動壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械廠；ARC-120型電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；PH050A型生化培養箱：上海一恒科技有限公司；HY-5型回旋振蕩器：金壇市盛藍儀器制造有限公司；T6紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司。

1.4 方法

1.4.1 培養基制備

固體斜面培養基（PDA培養基）：馬鈴薯20%、葡萄糖2%、瓊脂2%[14]；液體種子培養基I：葡萄糖3%、蛋白胨0.3%、KH2PO40.1%、MgSO40.05%、pH自然；液體種子培養基II：麥麩6%、酵母浸膏0.4%、KH2PO40.2%、MgSO40.1%、pH值。

1.4.2 接種及培養

將0.5 cm2菌塊接入固體斜面培養基，27℃培養至長滿菌絲。用接種鏟取兩塊0.5 cm2左右的菌塊轉接入液體培養基I中，25℃恒溫培養箱48 h，之后轉入搖床在25℃、150 r/min下進行液體培養，直至有均勻菌球長出。此時培養出來的菌體即為一級菌種。將一級菌種按接種量5%接入液體種子培養基II中，培養至菌球均勻，該菌體為二級菌種。

1.4.3 菌絲體干重的測定

將桑黃菌發酵液于3 000 r/min離心10 min，過濾上清液后得到桑黃菌絲體，用蒸餾水洗滌菌絲體至無色，于恒溫干燥箱中60℃下烘干至恒重，菌絲干重測定參照文獻進行[14]。

1.4.4 黃酮及可溶性蛋白含量測定的標準曲線制作

取桑黃菌深層發酵5 d的發酵液3 000 r/min離心10 min，取上清液進行黃酮和可溶性蛋白的含量測定，采用張靜[19]的方法進行。以槲皮素濃度（mg/mL）為橫坐標，以吸光度為縱坐標，在285nm波長下比色測定，繪出黃酮標準曲線，方程為y=36.800x+0.007 4，R2=0.996 7，具有良好的線性關系。以蛋白質濃度（mg/mL）為橫坐標，以吸光度為縱坐標，在595 nm波長下比色測定，繪出標準曲線。得到回歸線性方程為：y=5.8514x+0.0021；R2=0.997 1，具有良好的線性關系。發酵液中黃酮含量（mg/mL）=提取液濃度（mg/mL）×稀釋倍數。發酵液中可溶性蛋白含量（mg/mL）=提取液濃度（mg/mL）×稀釋倍數。

1.4.5 桑黃菌發酵最佳培養時間的確定

將9%的芝麻醬渣添加到液體種子培養基II中，桑黃菌接種量為5%。25℃、150 r/min培養7 d。從培養第2天開始每隔24 h取樣一次。樣品3 000 r/min離心10 min，取上清液，測定黃酮和可溶性蛋白的含量和菌絲體干重。確定桑黃菌發酵最佳培養時間。

1.4.6 培養基成分單因素條件的篩選

以發酵液中可溶性蛋白和黃酮含量及菌絲體干重為考察指標，分別摸索醬渣濃度、酵母浸膏濃度、無機鹽MgSO4和KH2PO4濃度等單因素的影響。

1.4.6.1 醬渣濃度的影響

在液體種子培養基II的基礎上分別添加不同濃度的芝麻醬渣（0%、3%、6%、9%、12%、15%），接種量為5%。25℃、150 r/min培養5 d。測定醬渣濃度對黃酮、可溶性蛋白含量和菌絲體干重的影響。

1.4.6.2 酵母浸膏濃度的影響

在液體種子培養基II的基礎上分別添加不同濃度的酵母浸膏（0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%），接種量為5%。25℃、150 r/min培養5 d。測定酵母浸膏濃度對黃酮和可溶性蛋白含量的影響和菌絲體干重的影響。

1.4.6.3 MgSO4和KH2PO4的濃度影響

在液體種子培養基II的基礎上分別添加不同濃度的 MgSO4（0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%）和KH2PO4（0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%），接種量為5%。25℃、150 r/min培養5d。測定MgSO4和KH2PO4濃度對黃酮和可溶性蛋白含量的影響和菌絲體干重的影響。

1.4.7 正交實驗設計及驗證實驗

在單因素試驗基礎上，按照表1設計正交設計因素表，分別以黃酮和蛋白質含量及菌絲體干重為檢測指標，獲得正交結果，利用SPSS17.1軟件處理和多指標平衡法獲得最佳配方，在最佳配方基礎上，進行三組平行驗證試驗。

1.4.8 數據分析方法

采用SPSS17.1軟件處理。

2 結果與分析

2.1 最佳培養時間的確定

通過考察不同發酵時間對桑黃發酵生產黃酮和可溶性蛋白質含量、菌絲體干重的影響，找出最佳培養時間，結果見圖1～圖3。

圖1 不同發酵時間對桑黃發酵液中黃酮含量的影響Fig.1 Effect of different fermentation time on the production of flavonoids in fermentation of Phellinus igniarius

圖2 不同發酵時間對桑黃發酵液中可溶性蛋白質含量的影響Fig.2 Effect of different fermentation time on the production of soluble protein content in fermentation of Phellinus igniarius

圖3 不同發酵時間對發酵液中桑黃菌菌絲體干重的影響Fig.3 Effect of different fermentation days on the production of mycelium dry weight of Phellinus igniarius fermentation

從圖1可見，發酵液中黃酮含量在培養第5天時達到最大值；從圖2可見，發酵液中蛋白質含量的變化有所不同，在培養第2天時，蛋白質含量比第3天時高，之后又開始上升直至達到最大值，即培養第5天時。分析原因可能是培養初期培養液中含有醬渣所致，醬渣中含有一定量蛋白質，但隨著培養基消耗培養液中的營養消耗，之后再回升才是真正發酵引起的；從圖3可見，發酵液中菌絲體干重在培養第5天時達到最大值。綜合3個指標，最佳培養時間確定為培養第5天。

2.2 培養基配方的單因素摸索結果

2.2.1 醬渣濃度的影響

在液體種子培養基II中分別添加不同濃度的芝麻醬渣（0%、3%、6%、9%、12%、15%），接種量為5%。25℃、150 r/min培養5 d。測定醬渣濃度對黃酮、可溶性蛋白含量和菌絲體干重的影響，結果見圖4～圖6。

圖4 不同濃度芝麻醬渣對桑黃菌深層發酵液中黃酮含量的影響Fig.4 Effect of different concentration of sesame sauce residue on flavonoids content produced in fermentation broth

圖5 不同濃度芝麻醬渣對桑黃菌深層發酵液中可溶性蛋白含量的影響Fig.5 Effect of different concentration of sesame sauce residue on the content of soluble protein produced in fermentation broth

圖6 不同濃度芝麻醬渣對桑黃菌深層發酵液中菌絲體干重的影響Fig.6 Effect of different concentration of sesame sauce residue on dry weight of mycelia produced in fermentation broth

從圖4～圖6中可以看出，黃酮含量、可溶性蛋白含量及菌絲體干重隨著醬渣濃度的升高先上升后下降。醬渣濃度為9%時，黃酮含量達到最大值2.112 mg/mL，可溶性蛋白含量達到最大值1.365 mg/mL，菌絲體干重達到最大1.34 g。綜合分析得到最優醬渣濃度為9%。

2.2.2 酵母浸膏濃度的影響

在液體種子培養基II分別添加不同濃度的酵母浸膏（0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%），接種量為5%。25℃、150 r/min培養5 d。測定酵母浸膏濃度對黃酮和可溶性蛋白含量的影響和菌絲體干重的影響，結果見圖 7～圖 9。

圖7 不同濃度酵母浸膏對桑黃菌深層發酵液中黃酮含量的影響Fig.7 Effect of different concentration of yeast extract on flavonoids content produced in fermentation broth

圖8 不同濃度酵母浸膏對桑黃菌深層發酵液中蛋白質含量的影響Fig.8 Effect of different concentration of yeast extract on the content of soluble protein produced in fermentation broth

圖9 不同濃度酵母浸膏對桑黃菌深層發酵液中菌絲體干重的影響Fig.9 Effect of different concentration of yeast extract on dry weight of mycelia produced in fermentation broth

從圖7～圖9中可以看出，黃酮含量、可溶性蛋白含量和菌絲體干重隨著酵母浸膏的升高先上升后下降。酵母浸膏為0.4%時，黃酮含量達到最大值1.211mg/mL，可溶性蛋白含量達到最大值1.352 mg/mL，菌絲體干重達到最大值1.25 g。綜合分析得到最優酵母浸膏濃度為0.4%。

2.2.3 不同濃度MgSO4和KH2PO4的影響

在液體種子培養基II分別添加不同濃度的MgSO4（0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%）和KH2PO4（0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%），接種量為5%。25℃、150 r/min培養5 d。測定MgSO4和KH2PO4濃度對黃酮和可溶性蛋白含量的影響和菌絲體干重的影響，結果見圖10～圖15。

圖10 不同濃度MgSO4對桑黃菌深層發酵液中黃酮含量的影響Fig.10 Effect of different concentration of MgSO4on flavonoids content produced in fermentation broth

圖11 不同濃度MgSO4對桑黃菌深層發酵液中蛋白質含量的影響Fig.11 Effect of different concentration of MgSO4on the content of soluble protein produced in fermentation broth

圖12 不同濃度MgSO4對桑黃菌深層發酵液中菌絲體干重的影響Fig.12 Effect of different concentration of MgSO4on dry weight of mycelia produced in fermentation broth

從圖10～圖12中可以看出，黃酮含量、可溶性蛋白含量和菌絲體干重隨著MgSO4濃度的升高先上升后下降。MgSO4濃度為0.1%時，黃酮含量達到最大值1.27 mg/mL，可溶性蛋白含量達到最大值1.23 mg/mL，菌絲體干重在MgSO4濃度為0.15%時達到最大值1.24 g。綜合分析得出最優MgSO4濃度為0.1%。從圖13～圖15中可見，黃酮含量、可溶性蛋白含量和菌絲體干重隨著KH2PO4濃度的升高先上升后下降。KH2PO4濃度為0.25%時，黃酮含量和菌絲體干重達到最大值分別為1.28 mg/mL和1.35g，可溶性蛋白含量在KH2PO4濃度為0.20%和0.25%時相差不大，達到最大值1.38 mg/mL，綜合分析得出最優KH2PO4濃度為0.25%。

圖13 不同濃度KH2PO4對桑黃菌深層發酵液中黃酮含量的影響Fig.13 Effect of different concentration of KH2PO4on flavonoids content produced in fermentation broth

圖14 不同濃度KH2PO4對桑黃菌深層發酵液中蛋白質含量的影響Fig.14 Effect of different concentration of KH2PO4on the content of soluble protein produced in fermentation broth

圖15 不同濃度KH2PO4對桑黃菌深層發酵液中菌絲體干重的影響Fig.15 Effect of different concentration of KH2PO4on dry weight of mycelia produced in fermentation broth

2.3 正交試驗結果

2.3.1 正交試驗因素表

根據篩選出的單因素結果，進行四因素四水平正交試驗，因素水平表見表1。

表1 正交試驗因素表Table 1 Four factors and four levels orthogonal test

2.3.2 正交試驗結果

按照表1設計的正交試驗因素表進行四因素四水平的正交實驗，以黃酮和蛋白質含量及菌絲體干重為測定指標獲得結果，并采用SPSS17.1軟件處理試驗數據，結果見表2。

表2 四因素四水平正交試驗結果Table 2 Results of orthogonal test of four factors and four levels

從表2可見，以黃酮含量為考察指標，得到的最優培養基配方為A4B3C4D1；以蛋白質含量為考察指標，得到的最優培養基配方為A4B2C1D1；以菌絲體干重為考察指標，得到的最優培養基配方為A4B3C4D3。各個培養基配方稍有不同。為了得到3個指標均較好的配方，采用綜合平衡法進行多指標分析，篩選獲得能兼顧黃酮和可溶性蛋白、菌絲體干重3個指標均衡的培養基優化方案。

2.3.3 多指標綜合分析法獲得優化配方

對因素A和C的分析：對三指標A4水平均最好；對因素B的分析：對于黃酮含量和菌絲體干重來說，B3水平最好。對于可溶性蛋白質來說，B2水平最好，B3水平次之，綜合3個指標，選擇B3水平；對因素C的分析：對于可溶性蛋白含量和菌絲體干重來說，均以C4最好，對于黃酮含量來說，C1水平最好，C4水平次之，綜合因素C選擇C4水平；對D因素的分析：對于黃酮含量和菌絲體干重說，D1水平最好。對于蛋白質含量來說，D3水平最好，D1水平也不差，綜合分析選擇D1。根據綜合平衡法，篩選出的最優培養基為配方為A4B3C4D1，即：醬渣12%、酵母浸膏0.4%、KH2PO40.25%、MgSO40.05%。

2.3.4 驗證試驗

按照最優配方進行3組平行驗證試驗，測得黃酮含量為2.033 mg/mL、可溶性蛋白質的含量1.667 mg/mL，菌絲體干重為1.866 g。

3 討論與結論

芝麻醬渣中含有豐富的營養物質，可以作為食用菌液體發酵培養基的主要成分，但芝麻醬渣含有大量的鹽分，添加過多會抑制食用菌的生長[13]。試驗用的醬渣是芝麻磨成油之后的副產品，本身含有的營養物質在菌體發酵過程中菌體得以應用，菌體長勢良好。芝麻醬渣可以代替麥麩作為桑黃菌液體發酵的培養基成分，并且添加后黃酮與可溶性蛋白的含量均較高，生產成本低。

桑黃發酵添加9%芝麻醬渣后，黃酮和可溶性蛋白的含量及菌絲體干重較其他醬渣濃度下高。最佳發酵時間為第5天。以黃酮和可溶性蛋白質含量及菌絲體干重為多指標篩選出的最佳培養基配方為：芝麻醬渣12%、酵母浸膏0.4%、KH2PO40.25%、MgSO40.05%，經過3次平行驗證試驗，得到黃酮的含量為2.033 mg/mL，可溶性蛋白質的含量為1.667 mg/mL，菌絲體干重為1.866 g。