玉米液化清液發酵生產檸檬酸工藝研究

張鴻飛，秦酈，蔣水星，畢付提，劉玲，張建華，王德培，*

（1.工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津300457；2.省部共建食品營養與安全國家重點實驗室，天津300457；3.天津科技大學生物工程學院，天津300457；4.山東日照金禾博源生化有限公司，山東日照276800）

檸檬酸是一種重要的有機酸，在食品工業、精細化工洗滌和化妝品行業，醫藥業[1-4]等市場需求大，并以每年3%～5%需求量遞增。我國是檸檬酸生產大國，2017年產量達到152萬噸，是全球重要的檸檬酸生產國和出口國。

目前檸檬酸發酵大都以玉米為原料，經過高溫噴射液化，以帶渣玉米液化液為培養基進行檸檬酸發酵生產。由于每批玉米營養成分存在很大差別，從而造成檸檬酸生產不穩定；此外，帶渣玉米液化液黏稠溶氧較差，需加大通風壓力，生產能耗大[5]；由于玉米渣中存在大量不被發酵利用的固形物，影響發酵過程精細控制，也造成提取相對困難。因此，帶渣玉米液化液發酵工藝亟待改變。以玉米清液進行檸檬酸發酵，有其獨特的優點。玉米粉液化去渣后，液化液中脂肪、蛋白質含量低，發酵醪液黏度低利于溶氧，降低能耗縮短發酵周期，提高轉化率；發酵液固形物少，濾液清，油脂少，有利于從檸檬酸發酵液中提取檸檬酸，提高回收率和產品質量；且液化后得到的濾渣可用于制備高品質的玉米蛋白飼料[6]，增加企業經濟收益。因此，進行檸檬酸清液發酵新型工藝研究，降低檸檬酸生產成本，具有重大意義。

本論文以營養成分相對穩定的玉米液化清液為原料，確定了檸檬酸生產的最佳生產條件，并進行中試生產，為大規模生產奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗菌株

黑曲霉（Aspergillus.niger）CGMCC1042：由天津科技大學微生物保藏中心保藏。

1.1.2 試劑

無水葡萄糖、酵母粉、瓊脂粉、（NH4）2SO4、KH2PO4、MgSO4、CuSO4、ZnSO4、CaCl2、KCl、大豆蛋白胨 （分析純）：天津市北方天醫試劑公司；FeSO4（分析純）：天津市四通化工廠；肌醇（分析純）：上海權旺生物科技有限公司；玉米漿（試劑級）：金豐玉米有限公司；α-淀粉酶（40 000 U/mL）：諾維信（中國）生物技術有限公司。

1.1.3 培養基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（potato dextrose agar，PDA）：馬鈴薯削皮切塊，稱取200 g，加入適量蒸餾水煮沸30 min，4層紗布過濾除渣，取清液加蒸餾水定容至1 L，加入2%葡萄糖充分溶解，加入瓊脂粉20 g，加熱充分溶解分裝斜面后，121℃，20 min滅菌。

玉米液化清液的制備：玉米粉與水以1∶4（g/mL）的比例混合，攪拌均勻后加熱到70℃，加入耐高溫的α-淀粉酶（0.5 kg/t），保溫10 min后加熱到90℃保溫4 h～5 h，趁熱經兩層紗布過濾得糖化清液。過濾清液冷卻后加水調整總糖到要求的濃度[7]。

種子基礎培養基：總糖10%的玉米液化清液，0.25%（NH4）2SO4，0.15%KH2PO4，500 mL 三角瓶裝液量 40 mL，121℃滅菌20 min。

發酵基礎培養基：總糖17%的玉米液化清液，0.2%KH2PO4，0.15%（NH4）2SO4，0.025%MgSO4，500 mL三角瓶裝液量50 mL，121℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

OLYMPUS 719068光學顯微鏡：OLYMPUS公司；LDZX-50FB立式壓力蒸汽滅菌鍋、SPX-250B-Z型生化培養箱：上海博迅實業有限公司醫療設備廠；FA2004N電子天平：上海精密科學儀器有限公司；DELTA320 pH計：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；HZQ-QX恒溫振蕩器：中國哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司；WYT-J總糖計（0～32%）：成都豪創光電儀器有限公司；HDL超凈工作臺：北京東聯哈爾濱儀器制造有限公司；30 L發酵罐：上海高機生物工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發酵培養基成分優化試驗

1.3.1.1 發酵培養基有機氮源種類單因素試驗

初糖濃度為17%的玉米液化清液添加0.15%（NH4）2SO4，在氮含量相同的前提下，以0.92%玉米漿、0.5%大豆蛋白胨、0.65%酵母粉、0.6%飼料蛋白作為有機氮源分別加入發酵培養基中。按10%接種量，330 r/min，36.5℃，搖床培養72 h，每組做兩個平行試驗，以最終產酸量及菌絲球形態為因變量，得出最佳的有機氮源并優化其添加量。

1.3.1.2 發酵培養基添加玉米漿單因素試驗

以初始發酵培養基為基礎，在玉米液化清液中添加 0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%、1.0%、1.2%、1.4%的玉米漿，另外添加0.15%（NH4）2SO4。按10%接種量，330 r/min，36.5℃，搖床培養72 h，每組做兩個平行試驗，測定最后的產酸量，確定玉米漿最終添加量。

1.3.1.3 發酵培養基添加（NH4）2SO4單因素試驗

糖濃度為17%的玉米液化清液，分別添加0.06%、0.08%、0.10%、0.12%、0.14%、0.16%、0.18%、0.20%（NH4）2SO4。按 10%接種量，330 r/min，36.5℃，搖床培養72 h，每組做兩個平行，以最終產酸量為因變量，得出最佳的（NH4）2SO4添加量。

1.3.1.4 發酵培養基添加肌醇單因素試驗

糖濃度為17%的玉米液化清液，分別添加肌醇終濃度0、0.001%、0.003%、0.005%、0.007%、0.009%。按10%接種量，330 r/min，36.5℃，搖床培養 72 h，每組做兩個平行，以最終產酸量及菌絲球形態為因變量，得出最佳的肌醇添加量。

1.3.1.5 發酵培養添加不同金屬離子正交試驗

對發酵培養基中 MgSO4、CuSO4、ZnSO4、CaCl2、KCl、FeSO46種金屬元素進行L27（36）正交試驗。按10%接種量，330 r/min，36.5℃，搖床培養72 h，每組做兩個平行，以最終產酸量為因變量，通過方差分析以確定6種金屬元素的最佳配比。正交試驗因素及水平表見表1，正交試驗因素的水平由單因素試驗確定。

表1 正交試驗設計各因素及水平Table 1 Levels of factors used in the orthogonal experimental design

1.3.2 玉米清液最佳發酵條件試驗

1.3.2.1 初糖含量對檸檬酸產量的影響

調整玉米液化清液初糖濃度分別為16%、17%、18%、19%、20%，按10%的接種量，控制發酵溫度36.5℃，攪拌轉速 400r/min，通風 400L/h，罐壓 0.1 MPa，進行發酵。發酵開始每隔8小時分別從各個不同初糖濃度的發酵罐中取樣，測定檸檬酸產量和發酵液pH值，放罐后進行菌絲體凈重測量，記錄凈重變化，以及殘還原糖測定。

1.3.2.2 種齡對檸檬酸產量的影響

選取培養 18、20、24、27 h 的種子液進行試驗，接種量為10%，測定最終檸檬酸產量，放罐后進行菌絲體凈重測量，記錄凈重變化以及殘還原糖測定。

1.3.2.3 溶氧對檸檬酸產量的影響

采用30 L全自動通風機械攪拌發酵罐進行發酵，調整發酵液初始糖濃度18%，調節初始pH 3.5。通風量調整如下：

方案A分三段控制通氣量：0～16 h：300 L/h，轉速300 r/min；17 h～48 h：450 L/h，轉速 450 r/min～500 r/min；49 h～58 h：350 L/h，轉速 300 r/min。

方案B發酵全程大通風量：0～60 h：450 L/h，轉速450 r/min～500 r/min；61 h～64 h：350 L/h，轉速 300 r/min。

1.3.2.4 檸檬酸產量的測定

取1mL發酵上清液于250mL三角瓶中，添加1滴～2滴酚酞做指示劑，用濃度為c的NaOH標準溶液滴定至淡粉色，30 s后不褪色[85]，讀取消耗NaOH標準溶的體積為V，則檸檬酸產量計算公式為：

式中：Y為檸檬酸產量，以一水檸檬酸計量，g/100 mL；c為NaOH標準溶液物質的量濃度，mol/L；V為NaOH標準溶液消耗體積，mL；0.142 9為滴定系數。

1.3.2.5 還原糖的測定

本試驗采用費林試劑熱滴定法，費林試劑由甲、乙兩種溶液組成，滴定時以亞甲基藍為指示劑。

1）空白滴定

準確吸取費林試劑甲液和乙液各5 mL于250 mL錐形瓶中，滴加約19 mL葡萄糖標準溶液，加熱使其在2 min內沸騰，準確沸騰30 s，趁熱以每2秒1滴的速度繼續滴加葡萄糖標準溶液，直至溶液藍色剛好褪去為終點。記錄消耗葡萄糖標準溶液的總體積。平行操作3次，取其平均值V1。

2）發酵液還原糖的測定

樣品溶液測定：取費林試劑甲液、乙液各5 mL，置于250 mL錐形瓶中，用移液管吸取經適當稀釋后發酵濾液0.1 mL置于錐形瓶中，加入2滴次甲基藍指示劑，從滴定管中加入比與測試樣品溶液消耗的總體積少1 mL的樣品溶液，加熱使其在2 min內沸騰，準確沸騰30 s，趁熱以先快后慢的速度從滴定管中滴加樣品溶液，滴定時要保持溶液呈沸騰狀態。待溶液由藍色變淺時，以每2秒1滴的速度滴定，直至溶液的藍色剛好褪去為終點。記錄樣品溶液消耗的體積，平行操作3次，取其平均值V2，計算公式為：

式中：V為標定時平均消耗還原糖樣品溶液的總體積，mL；N為還原糖樣品溶液的稀釋倍數；1 000為mg換算成g的系數。

1.3.2.6 產酸率的測定

式中：產酸率為檸檬酸生產速率，g/（100 mL·h）；Y為檸檬酸產量以一水檸檬酸計量，g/100 mL；t為發酵時間，h。

2 結果與分析

2.1 有機氮源對檸檬酸清液發酵的影響

2.1.1 不同有機氮源種類的選擇

不同有機氮源[8]對黑曲霉檸檬酸發酵，菌絲球形態，糖酸轉化率等具有顯著的影響，結果如圖1、圖2所示。

圖1 不同有機氮源對檸檬酸產量的影響Fig.1 The influence of different types of organic nitrogen sources on the production of citric acid

圖2 添加不同有機氮源發酵液菌絲球形態Fig.2 The mycelium pellet morphology after adding different organic nitrogen sources

由圖1可知，4種氮源對于產酸量的影響先后順序為玉米漿＞大豆蛋白胨＞蛋白飼料＞酵母粉，添加玉米漿時產酸量最高可達9.27 g/100 mL，糖酸轉化率均高于其它氮源，并且殘還原糖相對較少，大豆蛋白胨次之，添加玉米漿和大豆蛋白胨發酵性能優于添加其他有機氮源。由圖2可知，添加玉米漿和大豆蛋白胨時的菌絲球形態較好，菌絲球大小較為均一，菌絲擴散較少；添加酵母粉時的菌絲球形態不規則，且菌球直徑偏大；添加飼料蛋白時的菌絲球直徑一致性差，且菌絲擴散較多。綜合以上產酸量、轉化率、殘還原糖以及菌球形態考慮，4種有機氮源中，玉米漿與大豆蛋白胨發酵性能最好，但從生產成本問題考慮，最終選取玉米漿為檸檬酸玉米清液發酵最適有機氮源。

2.1.2 玉米漿加入量的確定

2.1.1試驗確定玉米漿為最佳有機氮源，玉米漿的濃度是關系檸檬酸是否能夠高效發酵的重要因素之一，通過測定最后的產酸量以及糖酸轉化率，確定玉米漿最適濃度。結果如圖3所示。

圖3 不同玉米漿含量對檸檬酸產量的影響Fig.3 The influence of different corn syrup content on the production of citric acid

由圖3可知，當玉米漿濃度為0.7%時黑曲霉產酸量及糖酸轉化率均最高，繼續增加玉米漿產酸量不再增加。綜合比較產酸量和轉化率指標，選取0.7%玉米漿作為發酵培養基的最佳有機氮源添加量。

2.2 不同濃度（NH4）2SO4對檸檬酸清液發酵的影響

研究表明[9]，在檸檬酸發酵過程中，添加一定量的（NH4）2SO4對檸檬酸產量有較明顯的提高。在發酵培養基中添加0.7%玉米漿后加不同終濃度的（NH4）2SO4，通過測定最后的產酸量和糖酸轉化率，從而確定玉米液化清液發酵培養基中（NH4）2SO4的最適濃度，結果如圖4。

圖4 不同（NH4）2SO4含量對檸檬酸產量的影響Fig.4 The influence of different（NH4）2SO4concentration on the production of citric acid

由圖4可知，發酵液中（NH4）2SO4的總濃度0.1%時，產酸量及糖酸轉化率均為最高。在添加其他濃度的（NH4）2SO4時，產酸量及糖酸轉化率均不理想，所以選擇0.1%作為（NH4）2SO4的最適總濃度。

2.3 不同濃度肌醇對檸檬酸清液發酵的影響

在發酵培養基中添加不同濃度的肌醇[10]，最終測定最后的產酸量并觀察菌絲球形態從而確定清液發酵培養基中肌醇的最適添加量，結果如圖5、圖6。

由圖5可知，從產酸量以及糖酸轉化率方面看，添加一定量的肌醇對提高產酸量有明顯作用，添加一定量肌醇的發酵產酸量均高于未添加肌醇的發酵產酸量，其中添加總濃度0.007%的肌醇時產酸量以及糖酸轉化率最高。從發酵完成后鏡檢圖6可知，未添加肌醇的菌絲球菌絲擴散，菌絲球不致密，當添加0.007%肌醇時，可明顯看出菌球纏繞的很緊密，向外伸展的菌絲較少，菌絲球形態規整，繼續增加肌醇濃度時，產酸量不再增加且菌絲球一致性下降，菌絲擴散較多。綜合以上因素考慮選取0.007%的肌醇為最優濃度。

圖5 不同肌醇含量對檸檬酸產量的影響Fig.5 The influence of different inositol content on the production of citric acid

圖6 添加不同濃度肌醇發酵液菌絲球形態Fig.6 The mycelium pellet morphology after adding different content of inositol

表2 正交試驗結果Table 2 Results of orthogonal experiment

2.4 6種金屬離子的濃度正交試驗及驗證

選取 MgSO4、CuSO4、ZnSO4、CaCl2、KCl、FeSO4[11-12]多種濃度進行正交試驗，正交試驗結果見表2，方差分析見表3。

由表 2 可知，MgSO4、CuSO4、ZnSO4、CaCl2、KCl、FeSO4這6個因素的不同水平中，通過極差分析可知，影響因子的主次順序為：CaCl2＞MgSO4＞KCl＞FeSO4＞ZnSO4＞CuSO4，最優組合為 A1B1C1D1E1F3，優化后的最優濃度：MgSO40.1 g/L，CuSO40.8 mg/L，ZnSO40.02 g/L，CaCl22.0 g/L，KCl 0.1 g/L，FeSO40.34 mg/L。

在最優濃度培養條件下，對優化結果進行驗證試驗，500 mL三角瓶裝液量 50 mL，36.5℃，330 r/min進行檸檬酸發酵72 h。驗證結果產酸量為9.96 g/100 mL，高于正交試驗中任何一組產酸量，驗證了最佳組合的優勢效應。

續表2 正交試驗結果Continue table 2 Results of orthogonal experiment

表3 正交試驗方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal test

2.5 玉米液化清液最佳發酵條件

2.5.1 不同初糖濃度對檸檬酸清液發酵的影響

選取不同初糖濃度玉米液化清液發酵進行發酵后，測定檸檬酸產量，殘還原糖及固形物含量，結果見表4。

由表4可知，當初糖濃度為18%時發酵結束時產酸量最高，糖酸轉化率最高，且殘還原糖濃度處于較低水平。由放罐后固形物含量可知，當初糖濃度18%以上時，固形物含量明顯升高，考慮到發酵液固形物含量對下游提取的影響，綜合以上因素，最終選取18%初糖濃度進行下一步研究。

2.5.2 種齡對檸檬酸清液發酵的影響

接種不同種齡的種子液進行發酵試驗，測定最終檸檬酸產量，殘還原糖并記錄相應發酵周期，結果見表5。

表4 發酵結束檸檬酸產量Table 4 The production of citric acid at the end of fermentation

表5 種齡對檸檬酸發酵的影響Table 5 The effect of different inoculation time on citric acid fermentation

由表5可知，隨著種齡的增大，檸檬酸酸產量逐漸增大，其中菌齡27 h時產酸量最高，因此選擇種齡27 h為黑曲霉菌種最佳移種時間。

2.5.3 不同工藝控制對檸檬酸清液發酵的影響

不同工藝控制，使發酵過程發酵液中溶氧濃度差異較大，而溶氧濃度[13-17]對檸檬酸發酵有極大的影響。從發酵開始每隔8小時取樣，測定發酵液中檸檬酸濃度、pH值的變化情況，每隔1小時記錄溶氧。結果如圖7、圖8所示。

圖7 不同工藝發酵檸檬酸溶氧曲線Fig.7 Different process fermentation citric acid dissolved oxygen curve

圖8 不同工藝對8 h檸檬酸積累的影響Fig.8 The influence of different processes on accumulation of citric acid for 8 hours

由圖7可知，0～16 h時，大通風量溶氧優于分段通風；16 h～64 h時，方案A溶氧高于方案B。結合圖8來看，方案B中，發酵前期溶氧過高，易引起菌體增殖過剩，導致黑曲霉過早進入檸檬酸累積期，pH值下降過快。低pH值會影響糖化酶活性，進而影響原料的利用率，使發酵液殘還原糖含量過高，故發酵后期方案B產酸量不如方案A。最終選取方案A三段式通風量進行下一步研究。

分段通風對檸檬酸發酵的影響見圖9。

由圖9可知，在發酵前期（0～16 h）控制通風量為300 L/h，菌體大量增殖，代謝正常，發酵液pH值為3.5，該pH值有利于保持發酵液糖化酶活力，使還原糖含量上升，發酵16 h之后黑曲霉進入快速產酸量期，17 h～48 h通風量調整為450 L/h，轉速450 r/min～500 r/min，此時黑曲霉菌絲球代謝更加旺盛，更多的還原糖轉化為檸檬酸，此時還原糖含量開始大幅度下降，產酸量開始大量增加；48 h以后接近發酵結束，49 h～58 h通風量調整為：通風350 L/h，轉速300 r/min，此時還原糖處于較低水平，溶氧較高，pH值相對穩定，可降低通風和轉速。在58 h發酵結束時，檸檬酸產量為18.33 g/100 mL，糖酸轉化率為101.8%，殘還原糖量為0.5%。而相同發酵工藝玉米帶渣發酵液發酵水平17.5 g/100 mL，轉化率99.5%，此清液發酵水平已高于帶渣發酵產量水平。

圖9 分段通風對檸檬酸發酵的影響Fig.9 The effect of segmented ventilation on citric acid fermentation

3 結論

本研究對玉米液化清液發酵生產檸檬酸的發酵培養基及培養條件進行優化，通過對氮源，營養因子，金屬離子的多次單因素試驗及正交試驗，最終確定發酵培養基成分為：玉米清液糖濃度為18%，玉米漿0.7%，（NH4）2SO41.0 g/L，MgSO40.1 g/L，CuSO40.8 mg/L，ZnSO40.02 g/L，CaCl22.0 g/L，KCl 0.1 g/L，FeSO40.34 mg/L，肌醇0.007%。在種齡27h，分段通風轉速控制的發酵條件下，發酵周期為60 h，檸檬酸產量達到18.33 g/100 mL，糖酸轉化率為101.8%，殘還原糖量為0.5%，而相同發酵工藝玉米帶渣發酵液發酵水平17.5 g/100 mL，轉化率99.5%，由此，玉米清液發酵有望成為檸檬酸新型發酵方式。