黃曲霉毒素降解技術及其降解產物研究進展

莫紫梅，袁光蔚，陳寧周，鄭娟梅，王警，王海波

（廣西-東盟食品藥品安全檢驗檢測中心，廣西南寧530021）

黃曲霉菌及其代謝產物黃曲霉毒素（aflatoxin，AFT）可誘發肝癌、乳腺癌等，嚴重威脅人類的健康，還會對糧食作物、水產、畜牧、養殖業等造成巨大的經濟損失[1]。糧食作物在生產、加工及流通過程中極易受黃曲霉菌及其代謝產物黃曲霉毒素的污染。廣西由于處于亞熱帶季風氣候區，氣候溫暖，熱量豐富，雨水豐沛，大部分地區年降雨量為1 500 mm～2 000 mm，這種高溫高濕的環境使花生、大豆等糧食作物更易受到黃曲霉菌及其代謝產物黃曲霉毒素的污染。有些食用油小作坊生產制作的食用油，在原料采購、運輸、保存到生產制作各個環節，由于缺乏相應的技術水平或者安全意識，制作的食用油存在黃曲霉毒素污染的情況不容忽視。因此，探索一種有效降解黃曲霉毒素的方法，成為迫切需要解決的問題。

目前，黃曲霉毒素降解脫毒主要有物理法、化學法和生物技術法，本文對黃曲霉毒素的降解技術以及降解產物的研究進展進行綜述，并對該領域進一步研究提出看法，為推動黃曲霉毒素降解應用，尋求建立一種高效、快捷、安全處理黃曲霉毒素的新方法提供參考。

1 黃曲霉毒素的降解技術與降解產物解析

黃曲霉毒素的脫毒途徑是將毒素降解為無毒的小分子物質、把毒素轉化成無毒化合物等方式。常規的脫毒方法主要有化學法、物理法、生物法和轉化解毒等[2]，其特點見表 1[3-5]。

1.1 物理降解技術及降解產物

1.1.1 輻照

輻照降解毒素的原理是利用電離輻射產生的高能射線使分子結構發生變化，從而改變其原有的生化特性，主要是通過發生加成反應、消去反應等轉變成為無毒或低毒的中間產物[6]，或者破壞其中的物質結構，實現毒素的降解[6]。目前主要有紫外線輻照、60Co、137Cs產生的γ射線、電子束等用于生物毒素的脫毒研究[7]，特別是AFT的脫毒。不同的脫毒方式，用于不同介質中AFT的降解，會產生不同的降解產物。

表1 脫毒技術特點[3-5]Table 1 The characteristic of detoxification technology

微波降解AFT是由于電磁振蕩效應誘導AFT發生降解，降解產物的毒性結構二氫呋喃環雙鍵被破壞[8]，微波輔助堿法降解稻米中黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）后降解產物，經超高效液相-四級桿串聯飛行時間質譜儀（ultra-performance liquid chromatography quadruple-time-of-flight mass，UPLC Q-TOF MS） 技術發現有 m/z 319.081 3、341.055 9、283.061 0、301.063 4、347.076 2等降解產物[8]。

電子束亦被學者用于黃曲霉毒素降解的研究，不同介質中的AFT，其降解行為、降解產物及路徑會有區別。花生粕經過電子束照射后，其中的AFB1會發生強烈的輻解反應，迅速引發了AFB1分子的氧化反應，使其斷裂成為一些不具有紫外吸收信號的小分子物質，而水中的AFB1經電子束照射后，其降解產物則為D1（C16H12O7）、D2（C16H16O6）、D3（C17H14O8）、D4（C15H12O6）、D5（C17H12O7）等 5 種，D2、D4 分子量小于 AFB1母核分子量，可能是分子結構發生基團斷裂現象，D1、D3、D5分子量大于AFB1母核分子量，可能是分子結構斷裂后又發生聚合反應，其降解過程是AFB1在C（6a）-O（7）處發生分子間氫提取反應，并在 C（1）-C（2）和 C（3）-C（3a）處發生消去反應生成 D4，AFB1在 C（8）-C（9）處發生加成反應生成D3，D3再發生消去反應、還原反應等生成D1、D2和D5，降解產物結構與AFB1類似，只在部分基團稍有不同[9]。

利用γ射線輻照AFB1研究目前主要應用在水溶液以及甲醇水溶液中，其降解機理遵循自由基反應機制[10]。不同介質中的AFB1經γ射線輻照后，由于在AFB1母核分子不同位置發生加成、重排、消去、取代等反應，則會產生很多不同的輻解產物。如甲醇-水體系中檢測到25個輻解產物，其產物分子式主要有A1（C17H14O7）、A2（C16H10O5）、A3（C14H10O6）、A4（C18H16O8）、A5（C16H14O7）、A6（C17H14O8），水溶液的降解產物主要有A1（C17H14O7）、A7（C17H12O7）、A8（C16H12O7）、A9（C16H10O6）。其可能的機理是：A1的不飽合度（double bond equivalents，DBE）排序為11，不飽合度較AFB1小1，說明AFB1的C8-C9位雙鍵可能發生了OH和H的加成反應；A2的DBE、不飽合度與AFB1相同，則表明AFB1在輻照過程中其苯環側鏈上脫甲氧基形成的；A3的DBE、不飽合度與AFB1相同，推斷是AFB1在輻照過程中，失去甲基，且伴隨一個呋喃環被分解，呋喃環中氧經過重排在五碳環被加成成為含氧的六碳環；A4的DBE排序為11，不飽合度較AFB1小1，表明AFB1呋喃環左側雙鍵發生了加成反應；A5的DBE、不飽合度均比AFB1小1，表明呋喃環左側雙鍵發生了加成反應，有OH和H的加成，且分子結構中缺少1個C，說明苯環側鏈的甲氧基被羥基取代[10]。

目前，紫外光照射在AFB1降解中的研究較多，而紫外光照射后產生的降解產物跟AFB1所處的介質、紫外光強度、照射時間等有關。乙腈體系中AFB1紫外光降解產物有 A（C14H10O6）、B（C17H14O6）、D（C16H13O5）等，其機理是C（AFB1）物質通過分子間氫提取反應生成 B（C17H14O6），接著在 C（9c）-O（10）位發生光加成反應，在 C（6a）-C（9a）處發生光消去反應，生成較穩定的A（C14H10O6）物質，D（C16H12O5）產物則由 AFB1母核在 C（11）-O（15）發生光消去反應生成[11]，見圖 1。

AFB1在水中的紫外光降解過程則是由AFB1的C（8）-C（9）位發生加成反應生成中間產物P1（C17H14O7），P1在 C（1）-O（14）位發生的光還原和 C（4）-O（12）發生的光消去反應形成P2（C16H14O6），同時P1在C（12）-O（13）位發生的光消去反應產生P3（C16H12O7），見圖2。

花生油中AFB1的紫外降解產物，得到2種可能的降解產物：F1（C18H33N3O3）和 F2（C12H22N2O2），這兩種產物的產生可能是由于AFB1分子結構中呋喃環末端雙鍵和內酯環發生取代和裂解反應形成的，并與花生油中的某些小分子化合物發生反應形成的，其具體過程可能如下：由于AFB1的分子結構中內酯環部分是不穩定的，在外界條件的影響下，會脫去羰基，丟失-CO，花生油經紫外照射后，其中的含氮化合物會發生裂化反應形成R-NH2、-NH2等小分子化合物，這些小分子化合物在AFB1結構的活性位點-右側五元環和呋喃環上可以發生加成和取代反應，一些-OH基團被-NH2基團取代，形成C16H14O4，再通過氫加成反應和一系列復雜的化學變化后，形成C19H33N3O4，然后丟失一個-OCH3產生F1，而F2可能是F1中的五元環裂解后形成的[12-13]，見圖 3。

圖1 乙腈溶液中AFB1可能的降解途徑Fig.1 The possible degradation way of AFB1in acetonitrile solution

圖2 水中AFB1可能的降解途徑Fig.2 The possible degradation way of AFB1in water solution

1.1.2 熱處理法

熱處理對AFB1具有一定的降解作用。鄭海燕[14]研究報道20 mg/L的AFB1經120℃處理后，熱降解效果不明顯，經210℃處理后，降解率可達93.8%，利用UPLC-Q-TOF-MS分析出AFB1在甲醇水溶液體系中的降解產物有C17H14O7和C18H16O7，降解產物的雙鍵被加成，不飽合度降低。常敬華[15]分析了面包加工過程中還原性添加劑對脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）毒素的影響，結果表明，面團發酵結束后，其DON毒素含量變化不明顯，烘烤后面包皮中DON毒素含量則降低7.9%～15.1%，而面包囊腫DON毒素含量則降低7.4%～17.1%。朱濤等[16]考察了干燥方式對土鱉蟲黃曲霉毒素含量的影響，結果表明，土鱉蟲黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）、黃曲霉毒素B2（aflatoxin B2，AFB2）、黃曲霉毒素G1（aflatoxin G1，AFG1）、黃曲霉毒素G2（aflatoxin G2，AFG2）含量與溫度及干燥時間有關。

圖3 花生油中AFB1可能的降解途徑Fig.3 The possible degradation way of AFB1in peanut oil

1.2 化學降解技術及降解產物

化學脫毒是采用酸處理、堿處理和氧化劑處理等能與生物毒素發生化學反應，破壞其化學結構，從而降低或消除其毒性的一種方法。

堿處理是使生物毒素分子結構中的內酯環被打開進而形成鹽，分子結構發生變化，導致毒性降低或者消失。羅小榮等[17]采用1%碳酸氫銨溶液和2%～5%氨水對蓮子進行清洗，發現兩者對黃曲霉素的去除率可達90%以上，是由于碳酸氫銨水溶液呈堿性，易分解為二氧化碳、氨和水；氨與AFB1發生脫羥作用，導致其內酯環發生裂解，達到脫毒目的。甲醇體系中AFB1在NaOH溶液作用下的降解產物可能是C12H11O2K，是由AFB1的雙呋喃環被完全破壞，氧雜萘鄰酮的內酯結構也脫掉了一個CO2基團，如圖4。

圖4 AFB1在氫氧化鈉處理中的降解途徑Fig.4 The possible degradation way of AFB1treated by NaOH

NaHSO3處理下的降解產物可能是C16H13O5，是由AFB1母體第一個呋喃環斷裂失去一個羰基形成[18]，見圖5。

圖5 AFB1在亞硫酸氫鈉處理中的降解途徑Fig.5 The possible degradation way of AFB1treated by NaHSO3

化學氧化劑通過改變生物毒素的功能基團改變其毒性，具有鈍化黃曲霉毒素的能力。氧化劑能夠破壞黃曲霉毒素，具有鈍化黃曲霉毒素的能力。常用氧化試劑有過氧化氫、臭氧、次氯酸鈉、氯氣等。鄭燕[18]研究了雙氧水濃度對甲醇介質中AFB1的降解效果影響，結果表明，3%雙氧水在室溫下放置12 h，降解率達55%。利用高分辨質譜研究推斷其降解產物為C14H9O4，可能是由AFB1母體第一個呋喃失去-C3H4O2，還有氧雜萘鄰酮結構中的六元環上的羰基和苯環上的甲氧基也遭破壞，見圖6。

陳冉[19]報道了臭氧對G族黃曲霉毒素的降解效果比B族好，且臭氧對AFG1、AFB2降解效率分別為70%和40%。臭氧降解AFG1的產物有C17H12O10、C18H16O11、C16H10O7、C16H10O10，其機理是臭氧破壞了黃曲霉毒素分子中的C8-C9位雙鍵，最終將其分解為有機酸、醛、酮、二氧化碳等小分子物質，AFB1和AFG1中C8-C9位為不飽和雙鍵，AFG1和AFG2中氧雜萘鄰酮部分含有酯基，臭氧易攻擊AFB1和AFG1中的C8-C9位雙鍵使其降解。羅小虎[20]利用超高效液相色譜串聯四級桿飛行時間質譜（UPLC Q-TOF MS）對不同臭氧體系下AFB1的降解產物進行結構解析，研究發現臭氧和臭氧水純體系與AFB1反應的主要降解產物有C16H16O6、C17H14O7、C16H14O5、C15H14O5、C17H12O6、C17H11O7、C17H23O9、C16H13O7、C16H17O6、C17H15O8、C16H15O7。根據產物結構分析，表明在臭氧和臭氧水純體系中，AFB1降解產物的生成途徑AFB1的臭氧加成反應歷程，臭氧分子作用為主，其反應機制主要是親電和親核機制。研究表明，臭氧通常最先破壞有機物的雙鍵，AFB1中C8-C9雙鍵最容易被臭氧破壞，但仍保留二氫呋喃和香豆素的基本結構。

圖6 AFB1在雙氧水處理中的降解途徑Fig.6 The possible degradation way of AFB1treated by H2O2

1.3 生物降解技術及降解產物

生物技術脫毒是目前的研究熱點之一，其機制是通過吸附作用或酶促反應降解毒素或者修飾毒素分子而達到脫毒的目的[15]。通過篩選的生物菌株或降解酶的菌液、分泌胞外酶、發酵液等降解黃曲霉毒素的研究技術已應用于了食品、飼料、制藥和環保等領域。崔玉琦[21]篩選出芽孢桿菌E-1-1-1，其在42℃，pH5.5，接種量為3%時對AFM1的降解率可達92.5%。左瑞雨[22]報道了乳酸菌、枯草芽孢桿菌和酵母菌單獨培養后以2∶1∶2混合，48h對AFB1的降解率可達82.72%。徐丹[23]報道黑曲霉FS10及其發酵產物對AFB1有較好的降解效果，這種降解酶是一種不耐熱的胞外酶，機理是酶促降解。發現AFB1經降解酶作用后熒光強度明顯減弱，且產生了分子量為286的物質。推測AFB1的降解途徑為：降解酶通過水解作用打開了AFB1的內酯環結構，生成具有β-酮酸結構的中間產物，然后進一步發生脫羧反應，生成了m/z286的物質，使得AFB1的毒性大大減弱。李文明[24]報道了施氏假單胞菌F4 降解 AFB1的研究，F4 懸浮液對 AFB1（5 μg/mL）培養72 h后的降解率達86.6%，培養102 h后檢測不到AFB1。利用紫外全掃描確定了AFB1降解產物可能的最大吸收波長為200 nm～210 nm和250 nm～260 nm之間，利用UPLC Q-TOF MS技術篩查出分子量為206.056 4（一級質譜）的降解產物C11H10O6，對此產物的極性、二級質譜碎片（54.984 4、70.979 0、81.032 4、110.974 2）進行結構解析，推導該產物可能的結構式是6-甲氧基-[4，9]苯并-2，10，11，13-四氫-[11，13-環氧乙烷]雙呋喃。

2 黃曲霉毒素降解產物的安全性評價

食物中黃曲霉毒素經脫毒技術去除或降解后，其降解產物的安全性評價成了學者們研究的熱點內容之一。食物經各種毒素降解技術后的安全性評價可通過食物品質、動物實驗來評價。

2.1 食物品質的安全性評價

花生油經紫外光照射后，酸價、過氧化值會顯著增加[9，11-12，25]，油酸、亞麻酸、花生一烯酸有所降低[25]，對花生油其他品質并無影響[11]，而花生油經微波處理后，其酸值、碘值、過氧化值、維生素E和反式脂肪酸均未發生顯著變化[26]，且AFB1降解產物對細胞基本不產生毒性作用[12]。堿煉脫毒對花生油品質影響很小，堿煉脫毒能改善花生油色澤，會導致花生油酸值、過氧化值升高，但不飽和脂肪酸無顯著變化[27]。

學者報道不同功率微波處理后牛乳的蛋白質、脂肪、維生素C含量之間差異極顯著，乳糖含量差異不顯著[28]。微波處理對稻米中米蛋白的溶解性、起泡性、持油性、體外消化性顯著提高，乳化性先提高后下降，持水性呈下降趨勢：總巰基、二硫鍵含量增多，表面疏水性顯著性增強，自由巰基含量減少，表明微波輔助處理可能首先誘導部分米蛋白發生聚集形成可溶性大分子聚集體，但隨著微波處理時間的進一步延長，米蛋白聚集體發生解聚形成小分子蛋白[8]。

電子束輻照會使花生粕中還原糖、總黃酮、棕櫚酸、亞油酸、油酸等含量會有少量增加，花生酸含量降低，粗脂肪、粗蛋白、氨基酸總量等無顯著變化[9]；對小麥淀粉和蛋白質分子有破壞作用，導致面粉的耐機械攪拌性和操作性變差，面粉的品質受到影響[29]。

經臭氧處理玉米中AFB1后，玉米水分含量下降，脂肪酸酯明顯升高，色澤、黏度和糊化等性能均發生改變[20]，對玉米中脂肪酸成分沒有影響，但會影響玉米油中的脂肪酸組成[30]。

2.2 毒理試驗的安全性評價

學者們應用Ames和細胞毒理實驗研究不同基質中AFB1降解產物的致突變性和細胞毒性，結果表明，經電子束輻照后，水體系中AFB1降解產物的致突變性降低50%以上，細胞活性降低18.61%，花生粕中AFB1降解產物已無毒性[9]；微波輻照降解花生油中AFB1后所產生的降解產物無致突變性，其毒性消失[26]；紫外輻照處理后的花生油無致突變性，HepG2細胞活性達95.54%，說明降解產物毒性降低[25]；AFB1污染的玉米經臭氧處理后，對昆明鼠毒性顯著降低，AFB1降解產物對HepG2人肝細胞的凋亡顯著減少，血清中主要指標谷丙轉氨酶活性、總蛋白、白蛋白和球蛋白含量跟正常組對比無顯著差異，肝臟組織有輕微組織學改變[20]；微波輔助堿法降解稻米中AFB1降解產物毒性較AFB1有所降低[8]；臭氧、二氧化氯和微波輔助堿法都能有效降低黃曲霉毒素的致突變性，從而提高花生的食用安全性，但花生油的酸值、過氧化值會有輕微提高，仍低于國家標準規定[31]。

對于生物技術脫毒后的安全性評價，眾學者通過動物試驗、Ames試驗和細胞毒理實驗均有報道。動物實驗研究證實，芬氏纖維微菌T3-5可降低盲腸大腸桿菌的數量，能改善AFB1對維鴨的生長性能的影響，緩解AFB1對肝臟的損傷作用并使腸道環境趨于正常，當加菌劑量為1×108cfu時對雛鴨肝臟和腎臟無損傷作用[32]。經施氏假單胞菌F4降解的AFB1產物的致突變性顯著降低[24]。解淀粉芽孢桿菌N-2對黃曲霉有顯著抑制效果，其安全無毒，對胃酸和膽鹽有耐受性，且能降低AFB1對動物的毒害作用[33]。

3 展望

黃曲霉毒素毒性巨大，危害嚴重，南方高溫高濕的環境使花生等糧食作物更易受到黃曲霉菌及其代謝產物黃曲霉毒素的污染，因此，食用油乃至食用農產品的黃曲霉毒素的脫毒工作尤為重要且艱巨。傳統食用油精煉工藝中采用化學堿液處理法去除食用油中黃曲霉度毒素，但會對油脂色、香、味及營養成分造成不同程度的破壞和影響，而且易帶來二次污染。對于同樣存在被毒素污染安全隱患的其他食物，為其找尋到一種安全、有效、可行、高效的脫毒方法破在眉睫。對輻解產物的結構、組成及毒性進行分析和安全性評估，建立完善的真菌毒素脫毒降解機制，將是今后一段時期內真菌毒素輻照降解技術研究與應用的重點。