苜蓿青貯過程中葉綠素降解代謝研究進展

靳思玉，李苗苗，曹 陽

（黑龍江八一農墾大學動物科技學院，黑龍江大慶 163319）

青貯的色澤評分是感官評定青貯發酵品質的重要指標之一。通過青貯色澤可以評定牧草青貯的發酵品質。發酵品質良好的牧草青貯具有與新鮮牧草非常接近的顏色，若青貯前牧草為綠色，則青貯后仍然保持或接近綠色、黃綠色。研究表明，牧草青貯在發酵過程中如果可溶性糖轉化成乳酸，即乳酸發酵則氣味芳香、顏色鮮綠，如果可溶性糖轉化成丁酸，即丁酸發酵則氣味酸臭、顏色傾向于暗綠或黑綠色。青貯飼料保持與新鮮苜蓿相似顏色的程度，主要由苜蓿枝葉內葉綠素（Chl）的含量決定。

1 葉綠素的穩定性和功能

葉綠素主要由螯合一個鎂離子的卟啉環和一個脂肪烴側鏈的植基或稱之為葉綠醇基（Phytol）兩部分組成（陳俊毅等，2014）。苜蓿等植物莖葉內的Chl主要包括葉綠素a和葉綠素b（Matile等，1996），它們的化學結構高度相似，只有吡咯環Ⅱ上的附加基團存在差異，分別是甲基（-CH3）和甲醛基（-CHO）。葉綠素分子的這種特定結構如果能夠在青貯過程中不被破壞，或者它的相關降解產物的結構不被破壞，那么高品質的青綠苜蓿青貯就應該具有苜蓿原料的鮮綠感官 （Playne等，2010；Bureenok 等，2005）。

1.1 葉綠素的穩定性 Chl分子通常很不穩定，在光、酸、堿、氧、氧化劑等條件下都會使其分解（Hendry 等，1987）。 King 等（2012）的研究揭示了不同植物的品種和收割階段也是影響植物色素以及其他化學成分的重要因素。此外，植物色素如Chl、β-胡蘿卜素等在紫外線、高溫條件下大部分會分解。苜蓿飼料收割后，在自然干燥后，大部分色素也會被分解。苜蓿等粗飼料中富含Chl等光合色素成分，其中Chl或葉綠醇基的含量受到植物品種、栽培技術、施肥以及貯藏等生產條件的影響 （Sarmadi 等 ，2016；Van 等 ，2009；Nozière 等 ，2006）。尤其在酸性條件下，Chl分子很容易失去卟啉環中的鎂成為去鎂 Chl（Koca等，2006）。

1.2 葉綠素的功能 Chl及其衍生物有造血、提供維生素、解毒、抗病和抗氧化等功能，例如葉黃素是視網膜組成成分（Chew 等，1996），β-胡蘿卜素是維生素E的合成原料（Brown等，1993），它們都具有提高免疫的功能，對動物機體具有積極作用（Büchert等，2011；Fukasawa 等，2010）。 Chl在瘤胃內通過生物氫化作用，葉綠醇會以游離態存在，葉綠醇再經過瘤胃微生物作用會生成植烷酸（Giron 等，2013；Abidi等，2013），這些植烷酸會隨著代謝沉積到牛奶和牛肉中。植烷酸具有調節胰島素和促進脂肪酸酸化作用 （Giron等，2013；David等，2013），對人類脂肪肝和糖尿病等具有緩解作用（林夏菁等，2012）。自上世紀90年代，消費者更加關注有機或功能性食品，如功能性牛奶（Bourn等，2002）。在奶制品中脂肪酸、類胡蘿卜素、脂溶性維生素的含量被認定為標記指標，通過這些數據可以準確地反映出動物管理水平和奶制品品質（Bourn等，2002）。有研究報道，在飼喂高Chl含量的飼料后，牛奶中植烷酸含量偏高（Markus等，2012）。由于植烷酸不僅是機體氧化代謝的重要能量來源，而且在糖脂代謝、脂肪細胞分化聚酯調控方面具有特殊的生物學功能，所以，對泌乳后期的乳牛飼喂高Chl或者葉綠醇含量的莖葉飼料，可以防止乳牛肥胖，在分娩前后可以有效抑制脂肪肝的發生。

植烷酸不能在哺乳動物體內合成 （Allen等，2008），在人類血漿中植烷酸濃度為0.04～11.5μmol/L（Brown等，1993），它們幾乎全部來自反芻動物產品，也就是說草食動物中只有牛、羊等反芻動物產品是植烷酸唯一來源（Allen等，2008）。因此，調制高品質的苜蓿青貯，不但可以減少飼料一般營養成分的損失，而且有效地保存苜蓿飼料中功能性成分Chl，并通過草食動物體內消化代謝，將更多的植烷酸沉積到牛奶和牛肉中，生產具有功能性的動物產品。

2 葉綠素國內外研究現狀

2.1 葉片衰老過程中葉綠素降解途徑 沈成國等（1998）在植物葉片衰老過程中葉綠素降解代謝的研究中表明，植物葉片葉綠素在自然環境中降解途徑有三步：第一步，葉綠素酶（Chlase）作用下Chl脫植基反應；第二步，脫鎂螯合酶（MDCase）作用下脫植基葉綠酸向脫鎂葉綠素酸a轉化；第三步，在脫鎂葉綠素酸雙氧酶（Pheide Dioxygenase）或者稱為脫鎂葉綠酸a單加氧酶（PAO）作用下卟啉環氧化開環反應。其中，由于卟啉環氧化開環反應與葉片的綠色褪去有關，因此第三步被認為是葉片衰老時葉色發黃的關鍵步驟。然而，Hrtensteinera（2006）經過進一步研究表明，葉綠素的降解代謝可以分為二個階段：第一個階段首先是葉綠素酶催化葉綠素（CLH）形成脫植基葉綠素，然后有一個金屬螯合物脫去鎂離子形成脫鎂葉綠酸a（Pheidea），脫鎂葉綠酸a經過由脫鎂葉綠酸a加氧酶（PAO）和紅色葉綠素代謝產物還原酶（PCCR）催化的兩部反應轉化成初生熒光葉綠素代謝產物（PFCC）；第二個階段是PFCC經過異構化形成非熒光葉綠素代謝產物（NCCs），最后轉化成單吡咯降解產物。Matile等（1999）認為葉綠素降解代謝的第一步是葉綠素在CLH的催化下生成脫植基葉綠素和植醇。然而，Schelbert等 （2009）發現，脫鎂葉綠素酶（PPH），這個酶能夠使脫鎂葉綠素水解成脫鎂葉綠酸。因此，葉綠素可以不經過CLH的脫脂基作用，而是首先失去鎂離子，然后在PPH的作用下生成脫鎂葉綠酸，之后反應繼續下去，使綠色植物的莖葉綠色消失。

2.2 青貯苜蓿中的葉綠素 當前多數研究集中在綠色植物在衰老、風干、蒸煮、自然褪色，或者保鮮貯藏過程中葉綠素的降解代謝，并且其研究方向也多集中于植物學和植物生理學等相關領域。然而在飼料學、動物營養學領域中，關于葉綠素代謝以及在飼料上的應用方面尚是初步階段；尤其在苜蓿青貯調制加工研究領域，盡管青貯苜蓿是用于反芻動物的重要的飼料之一 （Wilkinson等，2005），然而關于牧草青貯過程中葉綠素代謝方面的研究較少。Bruhn等（1978）對苜蓿在干燥貯藏過程對β-胡蘿卜素含量影響進行了研究。Lindqvist等（2012）研究了風干或青貯對豆莢和牧草混合物中β-胡蘿卜素含量的影響。雖然Koca等（2006）研究表明，在酸性條件下Chl分子很容易失去卟啉環中的鎂成為去鎂Chl而使植物葉片發生嚴重褪色，但我們的研究發現，發酵品質優良的苜蓿青貯色澤仍然接近新鮮的苜蓿，同時我們發現一些苜蓿青貯中葉綠素某些代謝產物如葉綠醇的摩爾數高于Chl，然而卻沒能檢測到Chl酸脂和游離態植烷醇，那么苜蓿青貯中的Chl究竟會如何進行降解代謝呢？為了科學地解開這一系列謎團，研究苜蓿青貯過程中葉綠素代謝規律迫在眉睫。

2.3 葉綠素降解相關基因表達 目前關于苜蓿青貯過程中葉綠素降解相關基因的研究鮮見報道。但有關蔬菜保鮮過程中葉綠素降解相關基因表達變化的研究比較多。Agustin等 （2011）和Costa等（2006）分別報道了與蔬菜葉綠素降解相關基因 BoCLH1、BoCLH2、BoPPH、BoPaO、BoRC-CR 等的表達。 Gómez-Lobato等（2012）的研究表明，經過果蔬保鮮劑（1-MCP）處理青花菜后，雖然沒有影響葉綠素降解基因BoCLH1的表達，但誘導了BoCLH2的表達，抑制了BoPPH、BoPaO和BoRCCR的表達。Agustin等（2011）在對青花菜衰老過程中葉綠素降解的研究中發現，葉綠素降解與BoCLH1和BoCLH2的表達不存在相關性，而與BoPPH的表達相關。樊艷燕等（2015）在對青花菜衰老過程中葉綠素降解相關基因的表達分析中發現，耐保鮮貯藏性不同的青花菜葉綠素降解機制不同，在此過程中葉綠素降解含量的變化主要通過BoCLH2、BoPPH、BoPaO 以及BoRCCR 的表達量進行調節，而BoCLH1主要在衰老初始期降解葉綠素。

如果苜蓿青貯過程與前面所述的綠色植物枝葉衰老過程中葉綠素降解代謝相似，那么必然會使苜蓿青貯喪失綠色。然而，我們在苜蓿青貯調制過程中發現發酵品質優良的青貯仍然表現出與原料苜蓿相近的色澤，顯然這與前面所述研究中的結論不同。由此推測，如果苜蓿青貯過程中，引起以上葉綠素降解途徑的相關降解基因表達發生改變，那么必然會影響葉綠素降解相關酶的活性，進而調控葉綠素降解代謝途徑，從而使青貯苜蓿繼續保持其原有的色澤。因此，測定分析苜蓿青貯過程中葉綠素代謝產物、酶活性以及相關基因表達的動態變化，可能會揭示苜蓿青貯過程中葉綠素降解代謝機制。