超高效液相色譜-串聯質譜法檢測飼料中喹烯酮和喹乙醇

劉雪紅， 宋 平， 孫進健

（大連市獸藥飼料監察所，遼寧大連 116037）

目前，飼料中喹乙醇與喹烯酮的檢測方法主要有酶聯免疫分析法（趙春保等，2008）、高效液相色譜法（劉發全等，2008）、高效液相色譜-串聯質譜法 （2349號公告-6，2015；2086號公告-5，2014）。免疫分析法樣品前處理簡單、檢測速度快，但容易產生假陽性或假陰性的結果；液相色譜法靈敏度較低，檢出限較高；液相色譜—串聯質譜法是應用較廣泛的檢測飼料中喹 啉類藥物的方法。文獻報道較多的是采用HLB固相萃取柱凈化，樣品前處理需配制多種試劑，操作步驟多，而且凈化所用固相萃取柱使用前需活化，備用液過柱后，需淋洗。整個前處理過程較長，費時費力。本文采用PRiME HLB固相萃取柱凈化，Atlantis T3色譜柱分離，僅需配制1種試劑，無需氮吹，且所用的固相萃取柱無需活化和淋洗，分析速度快、回收率高，能滿足定性、定量的要求。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備 電子天平RD-200，德國Sartorius公司；超聲波清洗器 KQ-250B，昆山市超聲儀器有限公司；立式低溫高速離心機CF16RN，日立公司；數顯強力渦旋混合器 MS3，德國 IKA公司；液相色譜質譜聯用儀UPLC XEVO TQ-S，美國Waters公司；色譜柱 Atlantis T3（2.1 mm×150 mm 5μm），美國Waters公司；色譜柱 ACQUITY UPLC BEH C18 （2.1mm×50mm 1.7μm），美國Waters公司；固相萃取柱 Oasis PRiME（HLB 3 mL 60 mg）。

1.2 藥品與試劑

1.2.1 標準品 喹乙醇批號H0061103，含量99.5%；喹烯酮 批號H0561305，含量99.6%，均來自中國獸醫藥品監察所。

1.2.2 供試品

1.2.2.1 空白樣品 乳豬配合飼料：遼寧禾豐牧業股份有限公司，經檢測不含喹乙醇和喹烯酮。

1.2.2.2 空白添加樣品 分別按照0.2、0.4、2 mg/kg的比例在空白樣品中添加喹乙醇和喹烯酮標準品，混勻。

1.2.3 試劑 甲醇、乙腈、甲酸色譜純，水為符合GB/T 6682規定的一級水。

0.1%甲酸溶液：量取1.0 mL甲酸與1000 mL水，混勻。 0.1%甲酸-乙腈（2+8）溶液：量取200 mL 0.1%甲酸溶液與800 mL乙腈，混勻。0.1%甲酸-乙腈（8+2）溶液：量取 800 mL 0.1%甲酸中溶液與200 mL乙腈，混勻。

1.2.4 混合標準貯備液（1000 μg/mL） 分別準確稱取喹乙醇和喹烯酮對照品各10 mg，于10 mL棕色容量瓶中，加2 mL二甲亞砜溶解，并用甲醇定容。-20℃密封避光保存，有效期為3個月。

1.2.5 混合標準工作液配制（10 μg/mL） 精密量取1.2.4項下混合標準貯備液1 mL用乙腈稀釋定容100 mL。-20℃密封避光保存，有效期為3個月。

喹烯酮和喹乙醇均對光敏感，見光易分解，所以在整個實驗過程中必須避光操作，所用的器皿應盡可能采用棕色。

1.3 樣品檢測

1.3.1 樣品處理

1.3.1.1 提取 稱取2.00 g試樣 （精確至0.01 g），于聚丙烯離心管中，加入0.1%甲酸-乙腈溶液（2+8）20 mL， 渦動 1 min，40℃ 超聲波清洗儀中超聲10 min。9000 r/min下離心15 min，備用。

1.3.1.2 凈化 精密量取1 mL上清液，直接過PRiME HLB固相萃取柱，收集全部流出液，精密量取3 mL水與之混勻，過0.22 μm濾膜供上機檢測。

1.3.2 液相色譜條件 色譜柱：Atlantis T3，柱溫：30℃，進樣量：5 μL，梯度洗脫程序見表 1。

表1 梯度洗脫程序

1.3.3 質譜條件 離子掃描方式：正離子，檢測方式：多反應監測，霧化器壓力：7.0 Bar，干燥氣流量：650 L/h，干燥氣溫度：400℃，毛細管電壓：3000 V定性、定量離子對和錐孔電壓及碰撞能量見表2。

表2 定性、定量離子對和錐孔電壓及碰撞能量

1.3.4 標準曲線繪制 精密量取1.2.5混合標準工作液逐級稀釋，以1.2.3.3稀釋液定容配制成濃度分別為 5、20、80、200、500 ng/mL 標準曲線溶液，混勻后上機測定。

2 結果

2.1 標準曲線 以特征離子質量色譜峰面積為縱坐標，標準溶液濃度（ng/mL）為橫坐標，繪制標準曲線。2種藥物在5～500 ng/mL時線性關系良好，相關系數均在0.996以上（表3）。

表3 2種藥物的標準曲線及相關系數

2.2 檢測限和定量限 添加適量混合標準工作液于空白飼料中，經提取后測定。根據特征質量色譜峰的信躁比S/N＞3為檢測限，信躁比S/N＞10為定量限，檢測到2種藥物的檢測限為0.06 mg/kg，定量限為0.2 mg/kg。空白飼料中添加0.2 mg/kg的2種藥物特征離子質量色譜圖見圖1。

圖1 空白飼料中添加0.2 mg/kg的2種藥物特征離子質量色譜圖

2.3 回收率及重復性實驗 在空白飼料中添加3個不同濃度（0.2、0.4、2 mg/kg）2 種藥物，進行回收率實驗，每個添加濃度做5個平行，連續測定3批，其平均回收率、相對標準偏差見表4。從表中實驗結果可以看出2種藥物的添加回收率為80%～95.5%，批內批間相對標準偏差均小于10%。

3 討論

3.1 選用Atlantis T3色譜柱分離，2種藥物峰形均良好。見圖1。采用C18色譜柱分離，喹烯酮峰形良好，喹乙醇受基質干擾，峰形很差，見圖2。

3.2 采用目前的方法進行檢測，與文獻中報道的液相色譜質譜法比較，減少試劑的使用及操作步驟，節省試劑和時間，提高了檢測效率。前處理方法比較見表5。

表4 2種藥物回收率及重復性實驗結果（n=5）

圖2 2種藥物（添加0.2 mg/kg）采用BEH C18色譜柱分離特征離子質量色譜圖

3.3 基質效應研究 由于液相色譜-串聯質譜存在基質效應，而且飼料樣品基質復雜，因此對樣品基質效應進行研究。比較3個不同條件下的信號峰面積：純的標準品溶液，樣品基質提取后添加，樣品基質提取前添加。在優化實驗條件下，用空白樣品按“1.3.1”方法制作空白基質，加入一定量標準溶液，制成基質標準溶液；在空白樣品中加入一定量標準溶液，按“1.3.1”方法制成基質匹配標準溶液；與相應濃度的純標準溶液比較。實驗結果發現，無明顯基質效應，因此定量時采用純的標準品曲線。

表5 2種前處理方法比較

4 結論

該檢測方法，定量限為0.2 mg/kg，在0.2、0.4、2 mg/kg添加水平下，喹乙醇和喹烯酮平均回收率為80%～95.5%，相對標準偏差均小于10%。實驗流程更簡單、更快速、更有效，適合大批量日常分析檢測。