蛋氨酸缺乏對雛雞抗氧化功能和免疫球蛋白的影響

蔣蓓蕾， 陳金拳， 吳邦元

（1.淮安生物工程高等職業學校，江蘇淮安 223200；2.江蘇食品藥品職業技術學院，江蘇淮安 223200；3.西華師范大學生命科學學院，四川南充 637009）

蛋氨酸作為畜禽日糧中必需氨基酸，禽類的第一限制性必需氨基酸，具有較高的營養價值和重要的生理功能（Oz等，2008；楊麗杰等，2004；胡杰等，2003），適量的蛋氨酸可促進畜禽生長發育，改善生產性能和胴體質量（Xie等，2007），也可增強動物的免疫功能 （Swain等，2000；瞿明仁等，1999）。若蛋氨酸缺乏將會影響動物的采食，導致其體重降低，影響其免疫器官發育，甚至導致免疫器官受損（Wu等，2013），也會導致動物患營養性疾病（Cummins等，1986）。

免疫球蛋白是介導體液免疫的主要抗體，也是衡量機體免疫功能的重要指標。蛋氨酸作為谷胱甘肽的前體氨基酸，在保護機體組織和細胞免受氧化損傷中發揮著重要的作用。本試驗擬飼喂雛雞蛋氨酸缺乏的日糧，探討其對雛雞抗氧化功能和免疫球蛋白含量的影響，為蛋氨酸在動物生產中的應用提供理論依據。

1 材料方法

1.1 試驗動物及日糧組成 1日齡科寶（Cobb）肉雞健雛 120 羽，體重（41±3）g，購于常州市廣大養殖有限公司。隨機分為2組，每組6個重復，每個重復10只雛雞，其中一個重復用于全程觀察記錄體重使用。各組雛雞分別飼養于試驗禽籠內，自由采食，飲用去離子水。管理方式與常規育雛一致，試驗期42 d。日糧配方參照肉雞NRC（1994）的營養標準（表1）。

表1 試驗日糧組成及營養水平

1.2 主要試劑和儀器 主要試劑：過氧化氫酶（CAT）測定試劑盒（A007-2）、總超氧化物歧化酶（T-SOD）測試盒（A001-1-1）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）測定試劑盒 （A005）、還原型谷胱甘肽（GSH）測定試劑盒（A006-1）、羥自由基測試試劑盒（A018）以及丙二醛（MDA）測定試劑盒（A003-1）（購自南京建成生物工程研究所，南京，中國），IgAELISA 試劑盒 （A003403）、IgG-ELISA 試劑盒（A003421）以及 IgM-ELISA 試劑盒（A003403）（上海撫生實業有限公司），生理鹽水，PBS緩沖液，冰醋酸（AR級，乙酸含量99%以上）。

主要儀器：分光光度計/酶標儀/半自動生化分析儀 （比色測定波長為532 nm）、恒溫水浴箱（孵育溫度為95℃以上）、臺式離心機、漩渦混勻器、微量移液器、注射器等。

1.3 試驗方法

1.3.1 臨床觀察 試驗第 7、14、21、28、35、42 天空腹稱取對照組及蛋氨酸缺乏組雛雞體重，全程觀察、統計分析兩組雛雞體重增長情況。

1.3.2 抗氧化指標的檢測 試驗第14、28、42天，對照組及蛋氨酸缺乏組每組隨機抽取5只雛雞，頸靜脈采血，分離血清（不抗凝），用于以下檢測抗氧化指標：SOD活性的檢測——羥胺法，CAT活性的檢測——紫外分光光度法，GSH-Px活性的檢測——DTNB顯色法比色法，GSH含量性的檢測——Pseudo-end Point分光光度法；抑制羥自由基的檢測——鄰苯三酚比色法，MDA含量的檢測——硫代巴比妥酸法TBA法。

具體檢測步驟參照南京建成生物工程研究所試劑說明書進行。

1.3.3 免疫球蛋白含量檢測 試驗第14、28、42天，每組隨機抽取5只雛雞，頸靜脈抗凝采血并分離血清，采用雞免疫球蛋白ELISA測定試劑盒分別測定血清中IgG、IgM和IgA的含量，操作步驟如下：

各組血清樣本40 μL，分別加入抗-IgA、抗-IgG以及抗-IgM抗體10 μL、鏈霉親和素-HRP 50 μL，蓋膜混勻后于 37℃孵育 60 min；清洗后加入顯色劑A 50 μL和顯色劑B 50 μL，混勻后37℃避光顯色10 min；各孔加入終止液50 μL，終止反應至藍色轉為黃色；以空白孔調零，450 nm波長測量各孔吸光度（OD值）。

按照說明書做標準曲線，根據標準品的濃度及對應的OD值計算出標準曲線回歸方程，再根據兩組中各測定血清樣品的OD值在回歸方程上計算出對應的樣品濃度即為對應免疫球蛋白的含量。

1.4 數據處理 數據經SPSS 16.0及Excel軟件統計。各組數據均以“平均數±標準差”表示，并用獨立樣本T檢驗分析法比較蛋氨酸缺乏組與對照組間差異的顯著性。其中P＜0.05表示與對照組相比差異顯著，P＜0.01表示與對照組相比差異極顯著。

2 試驗結果

2.1 臨床觀察 試驗第6天開始，蛋氨酸缺乏組雛雞采食量與對照組比較出現較小程度的下降。試驗期間對照組及蛋氨酸缺乏組雛雞均未死亡。蛋氨酸缺乏組雛雞的生長發育遲緩，與對照組比較，體重降低，體形小。兩組雛雞初始體重無顯著差異。14日齡至42日齡蛋氨酸缺乏組雛雞體重均顯著或極顯著低于對照組（P＜0.05或P＜0.01），體重分別降低了 40.54、191.6、218.4 g，如圖 1。

圖1 試驗雛雞體重增長

2.2 抗氧化指標檢測結果

2.2.1 SOD活性的變化 由圖2可見，SOD活性在14日齡時與對照組比較降低了21.73 U/mL，但不顯著（P＞0.05）；28日齡時SOD酶的活性顯著降低了55.52 U/mL （P＜0.05）；42日齡時活性極顯著降低（P＜0.01），降低了52.58 U/mL。

圖2 血清SOD活性變化

2.2.2 CAT活性的變化 如圖3所示，14日齡和28日齡時蛋氨酸缺乏組CAT酶活性與對照比較分別顯著降低 （P ＜ 0.05）14.54、17.31 U/g Hb；42日齡時，蛋氨酸缺乏組CAT酶的活性降低了 29.35 U/gHb（P ＜ 0.01）。

圖3 血清CAT活性變化

2.2.3 GSH-Px活性的變化 如圖4所示，GSH-Px活性在14日齡時與對照組比較均無顯著變化（P＞0.05），降低了79.71 U，28日齡和42日齡時蛋氨酸缺乏組GSH-Px活性顯著降低（P＜0.05），分別減少了 102、132.75 U。

圖4 血清GSH-Px活性變化

2.2.4 GSH含量性的變化 如圖5所示，GSH的含量變化較顯著，14日齡時蛋氨酸缺乏組GSH含量無顯著變化，僅降低了0.12 mg GSH/L（P＞0.05），28日齡和42日齡時GSH含量與對照組相比分別降低了 0.71、0.88 mg GSH/L（P ＜ 0.01）。

圖5 血清GSH含量性變化

2.2.5 抑制羥自由基的變化 如圖6所示，14日齡時蛋氨酸缺乏組抑制羥自由基能力與對照組相比無顯著的變化（P＞0.05），僅降低了1.1 U/mL；28日齡和42日齡時缺乏組抑制羥自由基能力顯著或極顯著降低 （P＜0.05或P＜0.01），分別降低了46.5、91.5 U/mL。

圖6 血清抑制羥自由基能力變化

2.2.6 MDA含量的變化 如圖7所示，MDA的含量在14日齡時蛋氨酸缺乏組與對照組相比升高了0.26 nmol/mL（P ＜ 0.05），28日齡和 42日齡時缺乏組MDA的含量分別升高了1.11、1.28 nmol/mL（P＜0.05或P＜0.01）。

圖7 血清MDA含量變化

2.3 免疫球蛋白含量檢測結果

2.3.1 IgA含量的變化 由圖8可見，14日齡時，蛋氨酸缺乏組IgA含量與對照組比較無顯著變化 （P＞0.05），28日齡和42日齡時，IgA含量與對照組比較差異極顯著（P＜0.01），分別降低2.22、3.07μg/mL。

圖8 血清IgA含量變化

2.3.2 IgG含量的變化 由圖9可見，14日齡和28日齡時，蛋氨酸缺乏組IgG含量與對照組相比分別顯著降低了 3.46和 3.55 μg/mL （P＜0.05），42日齡時，IgG含量極顯著低于對照組 （P＜0.01），降低了 7.16 μg/mL。

圖9 血清IgG含量變化

2.3.3 IgM含量的變化 由圖10可見，14日齡至42日齡時，蛋氨酸缺乏組IgM含量與對照組相比均顯著或極顯著低于對照組 （P＜0.05或P＜0.01），分別降低了 1.71、2.7、2.85 μg/mL。

圖10 血清IgM含量變化

3 討論

本試驗臨床研究發現，雛雞飼料中蛋氨酸缺乏會導致雛雞生長受到抑制，食欲減退等臨床癥狀，這與 Carew 等（2003）及 Konashi等（2000）研究報道的臨床癥狀相似。雛雞出現生長抑制可能主要是蛋白質沉積能力受到影響，即蛋氨酸對蛋白質的合成率和分解率起作用（容庭等，2008），蛋氨酸攝入不足就會影響蛋白質的合成，繼而導致雛雞生長受到抑制。

機體一直處于自由基產生和清除的平衡過程，若平衡失調，機體細胞就會有過多的氧化脂質類物質積聚，自由基的持續產生會超過細胞內的抗氧化防御機制，導致氧化應激（Halliwell，2007）。抗氧化防御機制最主要的即是抗氧化劑，它主要包括抗氧化酶類和非抗氧化酶類。抗氧化酶類有SOD和CAT，它們是組織細胞抗氧化的第一道防線，可以清除細胞產生的H2O2（Adedara等，2010）。本試驗研究發現，蛋氨酸缺乏組雛雞抗氧化酶SOD、CAT和GSH-Px活性均降低，最終導致羥自由基的產生而引起脂質過氧化作用。在非酶類抗氧化劑中GSH發揮著主要作用，它是機體氧化應激的早期生物學標志 （Gagliano等，2006）。本試驗中GSH-Px活性的降低可能也由于GSH活性的降低導致的。本試驗發現蛋氨酸缺乏組MDA含量均顯著升高。MDA是通過某些初級或次級脂質過氧化產物的分解產生的終產物。它的產生可以導致膜流動性的改變，并使膜的脆性增加（Chen等，1994），并產生許多生物分子，包括DNA、脂質、蛋白質、碳水化合物或任何相近的分子，最終一連串的連鎖反應導致機體組織細胞的損傷。而蛋氨酸缺乏導致氧化損傷可能是因為它作為谷胱甘肽的前體氨基酸，在保護細胞免受氧化損傷和抗氧化中發揮著十分重要的作用（Reed，1990；Reed 等，1977），其缺乏可導致自由基產生，最終因蛋氨酸缺乏誘導了雛雞機體的抗氧化功能降低。

免疫球蛋白尤其是血清中的免疫球蛋白是介導體液免疫的主要抗體，也是反映全身免疫水平或免疫應答水平的重要指標。本研究發現，蛋氨酸缺乏組雛雞血清IgA、IgG和IgM含量與對照組相比顯著或極顯著降低，其原因可能是與法氏囊結構受損后B淋巴細胞數量的減少有著密切的關系（Wu 等，2013），此結果也與張永翠等（2009）和侯永清等（2001）在新西蘭肉兔和斷奶仔豬上研究結果一致。由此推測蛋氨酸缺乏會導致雛雞漿細胞抗體產生過程受到抑制，從而使免疫球蛋白（I-gA、IgG和IgM）生成量減少，表明機體體液免疫功能受損。

4 結論

蛋氨酸缺乏可導致雛雞抗氧化功能和體液免疫功能下降，從而造成機體損傷和抵抗力降低。