LncRNAs在細胞衰老中的作用和治療靶標

戴凱琴，劉 俊，凌 霜，許錦文

(上海中醫藥大學交叉科學研究院穆拉德中藥現代研究中心，上海 201203)

細胞衰老是一種穩定的增殖性停滯狀態，這種不可逆的細胞停滯狀態可能由多種因素引起，如端粒縮短、癌基因誘導或氧化應激。除此之外，不同的細胞類型中，細胞衰老的形態和分子特征有所不同，例如明顯的扁平狀態，溶酶體β-半乳糖苷酶的活性增加，laminB1表達降低以及炎性因子的表達增加。雖然許多因素參與細胞衰老，但p53/p21和p16/Rb是不同細胞類型中細胞衰老的兩個主要調節途徑。衰老是一個復雜的生物過程，引發與年齡有關的諸多疾病，如心血管疾病、糖尿病、神經退行性疾病、癌癥。隨著表觀遺傳學的深入研究，人們越來越認識到長鏈非編碼 RNA(long non-coding RNAs，LncRNAs)顯示出高度的細胞和組織特異性，以及其作為細胞中調節因子的作用。本文將深入探討LncRNAs在細胞衰老中的作用機制。

1 LncRNAs

非編碼RNA(non-coding RNA, ncRNA)是指不編碼蛋白質的RNA，除廣為人知的核糖體RNA(ribosomal RNA, rRNA)、轉運RNA(transfer RNA, tRNA)外，還包括小核RNA(small nuclear RNA, snRNA)、小核仁RNA(small nucleolar RNA, snoRNA)、微小RNA(microRNA,miRNA) 等多種已知或未知功能的RNA。這些RNA的共同特點是可在基因組中轉錄，但是不翻譯成蛋白，如人基因組中50%～70% DNA可被普遍轉錄，但卻只有約2%形成蛋白質。基因組學早期研究認為，除rRNA、tRNA之外的ncRNA是基因組轉錄的噪音，為RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymerase Ⅱ，RNA Pol Ⅱ)轉錄的副產物，不具有生物學功能。但隨著人們對ncRNA的認識逐漸深入，很多非編碼RNA，包括miRNA、LncRNA以及環狀RNA(circular RNA，circRNA)等均具有調控功能，參與重要且復雜的生物學過程。此外，ncRNA的高比例可能與物種調控水平的復雜性有關，如ncRNA在原核生物基因組中比例小于25%，植物和后生動物中比例大于60%，人類中ncRNA比例最高，約為98.5%，這說明ncRNA比例越高，生物調控的復雜度也更高。

2 LncRNAs參與細胞衰老的機制

在衰老過程中，已發現許多LncRNAs的表達受到明顯的影響。多因素參與細胞衰老， p53/p21和p16/Rb是不同細胞類型中細胞衰老的主要調節途徑。細胞衰老作為一種強大的腫瘤抑制機制已經被廣泛研究，以抵抗致癌基因的出現。本文主要探討與衰老相關的LncRNAs的研究，主要針對特殊的衰老途徑(p53/p21和p16/Rb)和染色體端粒。

2.1與端粒相關的LncRNAs復制衰老與端粒長度的逐漸縮短有關。非編碼端粒重復RNA (telomeric repeat containing RNA, TERRA)是由 RNA Pol Ⅱ將端粒從亞端粒區域轉錄而成，已被證明可以調節端粒的長度。最近的研究表明，TERRA具有引發早期衰老和端粒重組的獨特功能。在THO復合突變體中，轉錄的TERRA能侵入雙鏈體端粒DNA以形成DNA-RNA雜合，抑制染色體端帽形成和保護端粒末端外切核酸酶1(exonuclease 1, Exo1)，從而誘導端粒縮短[1]。然而，在沒有端粒酶、THO復合突變體的情況下，TERRA和端粒之間產生的R環并誘導端粒重組，從而延緩衰老[2]。研究也表明，釀酒酵母端粒酶RNA(telomerase component 1, TLC1)是擁有3個支臂的靈活支架，TLC1中的EST1臂結構域通過異源RNA蛋白結合模塊，將端粒酶催化亞基1(ever-shorter telomeres 1,Est1)與端粒結合蛋白(cell division control 13, Cdc13)連接起來，相互作用招募端粒酶到端粒；除此之外，第2個必需的Est1臂結構域(second essential Est1-arm domain，SEED)可能在Est1-Cdc13介導的端粒酶募集到端粒后，在端粒酶介導的端粒延伸中發揮重要作用[3]。

2.2與p53/p21途徑相關的LncRNAs許多因素調節p53/p21衰老途徑，包括轉錄因子、RNA結合蛋白和microRNA，如p53、p21、人抗原R(human antigen R, HuR)、Myb結合蛋白1A(Myb-binding protein 1A, MYBBP1A)、乳腺癌缺失基因1(depleted in breast cancer 1, DBC1)、miR-22和miR-424。已經報道了一些LncRNAs以不同的方式調節p53/p21途徑。下面主要討論LncRNAs通過轉錄和轉錄后基因表達對此途徑的影響。

2.2.1在轉錄過程的作用 LncRNA-pint(p53 induced noncoding transcript, pint)是由p53誘導，調節細胞活力和增殖的LncRNA。Pint與PRC2直接相互作用，是PRC2靶向組蛋白H3上賴氨酸27的三甲基化(trimethylation of lysine 27 on histone H3, H3K27me3)所必需的。在存在DNA損傷的情況下，Pint作為細胞周期停滯的負調節劑，并作為促生存分子，通過負調節p53活性而負反饋調節整個p53途徑[4]。LncRNA-PR-LncRNA-1(p53-regulated lncRNA 1, PR-LncRNA-1)主要位于細胞核，直接受p53調控。在DNA損傷的情況下，PR-LncRNA-1通過蛋白質-RNA相互作用，與Sam68(src-associated substrate during mitosis of 68 ku, Sam68)作用，有效地向p21啟動子募集p53，促進p21的轉錄，調節細胞周期。這些發現提示了一種正反饋機制，PR-lncRNA-1是重要的Sam68相關的RNA，與Sam68/p53啟動子募集至關重要[5]。

2.2.2在轉錄后的作用

2.2.2.1與前mRNA的剪接相關的LncRNAs 由p53誘導的PANDAR參與B細胞淋巴瘤/白血病-X短鏈(B-cell leukaemia/lymphoma-X short, BCL-XS)mRNA可變剪接的調節。在正常PANDAR表達的細胞中，聚嘧啶束結合蛋白1(partners polypyrimidine tract-binding protein 1, PTBP1)與BCL-XS前mRNA結合，以調節促凋亡BCL-XS mRNA的可變剪接；在具有上調的PANDAR水平的細胞中，PANDAR可以充當PTBP1的誘餌，從而減少BCL-XS mRNA變體，抑制細胞凋亡[6]。

2.2.2.2與蛋白翻譯相關的LncRNAs LncRNA-7SL與TP53 mRNA的3′非翻譯區(UTR)形成部分雜交體，與HuR之間競爭結合TP53 3′-UTR，降低TP53 mRNA穩定并抑制p53翻譯，進而影響p53水平和p53的生長抑制功能[7]。

2.2.2.3與蛋白穩定相關的LncRNAs LncRNA-PURPL(p53 upregulated regulator of p53 levels, PURPL)是一種DNA損傷后直接受p53調控的非編碼RNA。RNA結合蛋白HuR作為潛在的接頭蛋白，募集PURPL與MYBBP1A結合，并抑制p53-MYBBP1A復合物的形成。在沒有PURPL的情況下，MYBBP1A與p53相互作用并穩定p53。沉默MYBBP1A明顯挽救PURPL缺陷細胞中的基礎p53水平和增殖，表明MYBBP1A介導PURPL在調節p53中的作用。證明了PURPL在維持基礎p53水平中的作用，p53-PURPL自動調節反饋回路[8]。LncRNA-DINO(damage induced noncoding, DINO)是一種保守的CDKN1A上游LncRNA，也是DNA損傷反應(DNA damage response, DDR)的一個新的組成部分。在沒有DNA損傷的情況，環己酰亞胺追蹤結果顯示，p53蛋白在對照細胞中快速降解；而當人或小鼠過表達DINO時，p53穩定化和p21蛋白水平均增加。DINO通過直接結合p53并穩定p53蛋白，介導p53自身擴增環。DINO可以產生具有其同源轉錄因子的反饋環以擴增細胞信號傳導網絡[9]。

2.2.2.4與蛋白活化相關的LncRNAs LncRNA-MALAT1(metastasis associated lung adenocarcinoma transcript1, MALAT1)首次在非小細胞肺癌中被發現，MALAT1在癌癥中起重要作用，作為各種基因的轉錄調節因子，包括涉及細胞增殖、遷移和轉移的基因。MALAT1與含有LZ結構域的DBC1的aa120-280區域結合，從而阻斷信息調節因子2相關酶1(Sirtuin 1, SIRT1)和DBC1之間的相互作用，增強SIRT1的脫乙酰活性，影響其下游靶基因譜的轉錄。p53轉錄激活許多基因并誘導細胞周期停滯、細胞衰老[10]。

2.2.2.5與microRNA相關的LncRNAs LncRNA-GUARDIN是一種p53誘導型效應子，GUARDIN在DNA修復和防止端粒損傷中具有重要作用。GUARDIN作為具有吸附miRNA-23a作用的分子海綿(molecular sponge)，通過競爭性結合miR-23a，促進端粒重復結合因子2(telomeric repeat binding factor 2, TRF2)表達，防止端粒末端損傷。因此，GUARDIN沉默引發細胞凋亡和衰老[11]。LncRNA-OIP5-AS1(Opa interacting protein 5 antisense transcript 1, OIP5-AS1)是一個與HuR相互作用的新轉錄本，抑制多種惡性腫瘤細胞增殖。HuR結合OIP5-AS1并穩定此LncRNA，反過來，OIP5-AS1又作為HuR的海綿。miR-424與OIP5-AS1相互作用，并與HuR競爭結合OIP5-AS1。降低HuR能增強miR-424與OIP5-AS1的結合；而miR-424的過表達降低了HuR與OIP5-AS1的結合，進而釋放HuR以結合編碼增殖蛋白的靶mRNA(TP53、Stir1等)。以這種方式，miR-424和HuR競爭結合OIP5-AS1來調控HuR與mRNA的結合，從而影響HuR誘導的增殖表型[12]。

2.3與p16/RB途徑相關的LncRNAs已經報道的一些LncRNAs，以不同的方式調節p16/RB途徑。大多數LncRNAs都起著轉錄調節因子的作用，通過與特定的染色質修飾或轉錄因子結合，抑制或激活轉錄。迄今為止，關于p16/RB途徑細胞質中的LncRNAs分子機制研究比較少。

2.3.1在轉錄過程的作用 LncRNA-ANRIL(CDKN2B antisense RNA 1, CDKN2B-AS1/ANRIL)是從CDKN2B基因座以反義方向轉錄的。ANRIL通過募集PRC1的組成成分色素框同源蛋白7(chromobox 7, CBX7)，增加H3K27甲基化，促進CDKN2A/CDKN2B基因座的表觀遺傳沉默，從而抑制細胞衰老[13]。LncRNA-MIR31HG(MIR31hostgene, MIR31HG)位于9號染色體上INK4A基因座上游400 kb處，MIR31HG下調可以減少細胞生長，并且促進強烈的衰老表型。在正常條件下，MIR31HG位于細胞核和細胞質中。核MIR31HG與復合物PRC1和PRC2相互作用以抑制p16INK4A表達；在癌基因誘導的衰老后，MIR31HG被高度上調并輸出到細胞質中，從而減輕CDKN2A基因座的抑制[14]。LncRNA-VAD(vlinc RNA antisense to DDAH1，VAD)在癌基因誘導的衰老中上調，激活CDKN2A基因座的轉錄，并促進衰老。VAD通過抑制H2A組蛋白家族成員Z(H2A histone family, member Z, H2A.Z)，與INK4基因座的結合，激活INK4基因座細胞周期抑制劑的基因表達，從而促進p16和p14的表達[15]。

2.3.2在轉錄后的作用 LncRNA-UCA1(urothelial cancer associated 1, UCA1)在膀胱癌及其他癌癥中上調。UCA1是CAPERα/ TBX3抑制的直接靶標，其過表達可誘導衰老。在增殖細胞中，CAPERα/TBX3蛋白復合物阻止UCA1 RNA的產生，人異質性胞核核糖核蛋白A1(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1, hnRNPA1)結合并使CDKN2A-p16INK mRNA不穩定；而在衰老期間，CAPERα/TBX3復合物分離，UCA1上調并隔離hnRNPA1，因此穩定CDKN2A-p16INK[16]。

2.4與其他衰老特征相關的LncRNAsLncRNA-DDSR1(DNA damage-sensitive RNA1, DDSR1)在DNA損傷時以ATM-NF-κB途徑依賴性方式誘導。DDSR1缺失損害細胞增殖和DNA損傷應答信號，并通過同源重組(homologous recombination，HR) 降低DNA修復能力。DDSR1通過與異質核核糖核蛋白U樣蛋白1(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein U like 1, hnRNPUL1)之間的相互作用，來調節乳腺癌1型易感蛋白(breast cancer type 1 susceptibility protein, BRCA1)和受體相關蛋白80(receptor-associated protein 80, RAP80)進入DNA雙鏈斷裂位點，從而調節HR[17]。LncRNA-HOTAIR(HOX transcript antisense RNA, HOTAIR)是位于12號染色體上HOXC簇中的LncRNA，并調節2號染色體上的HOXD基因簇。HOTAIR通過降低Iκ-Bα(NF-κB抑制劑)，調節NF-κB的活化，并在DNA損傷期間誘導持續的NF-κB活化和NF-κB靶基因的表達。NF-κB-HOTAIR軸在DDR期間驅動正反饋環級聯反應，并有助于卵巢癌和其他癌癥的細胞衰老和化療耐藥[18]。LncRNA-Zeb2-NAT是Zeb2的天然反義鏈，其控制鋅指盒裝E型盒裝同源盒2(zinc finger E-box-binding homeobox 2, Zeb2)的表達。Zeb2-NAT調節小鼠成纖維細胞和胚胎干細胞的ZEB2蛋白質的表達。降低Zeb2-NAT RNA的水平，有利于OSKM誘導的老年細胞全能干細胞的產生。此外，還發現當胚胎干細胞接受信號時，Zeb2-NAT表達迅速上調，并且阻斷Zeb2的表達，從而影響胚胎干細胞的自我更新和多能性[19]。

3 以LncRNAs為靶點的治療

ncRNAs在細胞發育和代謝中呈現功能多樣性，它們通過多靶點、多途徑調節基因表達的各個方面，包括染色質重塑、轉錄、加工和轉錄后修飾[20]。LncRNAs顯示出強的組織特異性，可能成為某些疾病的新治療靶點，目前研究主要集中癌癥治療。LncRNA-CLMAT3(colorectal liver metastasis associated transcript 3, CLMAT3)的過表達與結腸直腸肝轉移明顯相關，并且是結直腸癌患者存活率差的獨立預測因子。CLMAT3敲低增強鈣黏蛋白1(cadherin 1, Cdh1)表達，并通過增加S期激酶相關蛋白2(S-phase kinase associated protein 2, Skp2)蛋白泛素化，導致p27Kip積累，從而使細胞周期停滯在G0/G1期，控制細胞增殖[21]。LncRNA-HOXA-AS3(HOXA cluster antisense RNA 3, HOXA-AS3)在肺腺癌組織和A549細胞中明顯上調。HOXA-AS3通過形成RNA雙鏈體，增加了HOXA6 mRNA的穩定性。敲除HOXA-AS3后，細胞增殖、遷移和侵襲受到抑制。同時，HOXA-AS3與NF110結合，調節HOXA-AS3的細胞定位。HOXA-AS3在肺腺癌中被激活，并促進癌細胞發展。因此，HOXA-AS3可能成為肺腺癌的有效治療靶點[22]。

最近研究表明，實現RNA為生物活性小分子藥物靶點的長期目標是可能的。比如，新發現的1個與miR-54結合的萘啶類小分子化合物，抑制逆轉腫瘤細胞的缺氧生理反應，導致腫瘤細胞凋亡，其生物學效應比miRNA拮抗劑2′-O-甲基RNA濃度低25倍，并具有選擇性[23]。由于長鏈非編碼RNA只有少數被純化，因而定量LncRNA蛋白相互作用是一種可行的分析靶向LncRNA小分子的有效方法[24]。最近研究報道，運用高通量篩選方法，發現Ellipticine能夠靶向LncRNA BDNF-AS與組蛋白-賴氨酸N-甲基轉移酶相互作用[25]。盡管目前這類藥物發現還不多，但靶向RNA的小分子藥物是一種新的藥物開發趨勢。

4 小結

近年來，LncRNAs由于其多種生物學功能和作為新型治療靶點的潛力而一直處于分子生物學的前沿。因此，我們已經開始了解其分子功能，以及這些過程如何影響疾病的發展。隨著年齡的增長而出現的許多疾病，包括肥胖、糖尿病、衰老體虛、癌癥和神經變性，其特征在于表達的轉錄物的模式改變。正如本綜述所討論的，LncRNA在p53/p21和p16 衰老途徑中，可通過轉錄和轉錄后調控過程調節蛋白質。由于LncRNAs的保守性很差，從而限制了從動物模型到人類臨床發展。衰老細胞中LncRNAs的研究還處于起步階段，許多問題仍然存在于這些轉錄本影響細胞功能的程度，以及它們是否能夠成為相關疾病的治療靶點(如癌癥、神經變性、動脈粥樣硬化等)，還需要進一步的深入研究。