雙氯芬酸鈉注射液的溶血性及主動全身過敏反應試驗

秦 哲 ， 楊亞軍 ， 劉希望 ， 李世宏 ， 孔曉軍 ， 焦增華 ， 郭玉凡 ， 李劍勇

(1. 中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所 農業部獸用藥物創制重點實驗室 甘肅省新獸藥工程重點實驗室 ， 甘肅 蘭州 730050 ； 2. 鄭州百瑞動物藥業有限公司 ， 河南 鄭州 450000)

雙氯芬酸鈉為芳基乙酸類第三代強效非甾體抗炎藥(NSAIDs)，具有良好的抗炎、鎮痛、解熱和抗風濕作用，與同類藥物相比具有療效好、副作用小、長期應用無蓄積性、給藥后吸收迅速、有效血藥濃度維持時間較長等優點。在國內外獸醫臨床實踐中，該藥被用于緩解家畜手術、外傷、關節炎等引起的疼痛，以及細菌感染和其他疾病繼發感染引起的高熱[1]，受到獸醫臨床和動保企業的青睞。國內目前已有相關的注射劑被批準用于豬[2]，但是暫未批準用于奶牛。溶血性試驗和主動全身過敏反應試驗是評價注射劑安全性的重要檢驗項目[3]。本研究采用體外試管法，觀察試驗24 h內5%雙氯芬酸鈉注射液致溶血與紅細胞凝集現象，評價其溶血性。豚鼠主動全身過敏試驗中通過整體反應癥狀判斷過敏反應發生情況及其反應程度。為雙氯芬酸鈉注射液的臨床前安全性評價提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 雙氯芬酸鈉注射液(中試產品)，規格10 mL∶0.5 g，批號：20150826；注射液空白溶劑，鄭州百瑞動物藥業有限公司生產；牛血清白蛋白，生工生物工程(上海)股份有限公司，LJ0525B10011。

1.2 儀器與設備 ME235S分析天平，德國賽多利斯公司；SW-CJ-2FD型超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；MULTIFUGE X3R離心機，美國賽默飛世爾科技公司。

1.3 實驗動物 普通級雌性日本大耳白兔1只，體重2.5 kg；SPF級雄性Dunkin-Hartley豚鼠60只，體重300～400 g，實驗動物購自中國農業科學院蘭州獸醫研究所實驗動物中心，動物生產許可證號：SCXK(甘)2010-0001。

1.4 溶血性試驗

1.4.1 紅細胞混懸液的制備 采用常規方法制備2%兔血紅細胞混懸液。

1.4.2 受試藥物的制備 用0.9%氯化鈉溶液1∶3稀釋雙氯芬酸鈉注射液作為供試品溶液。

1.4.3 溶血性試驗 潔凈試管21支，分7組，各組均加入2%兔紅細胞混懸液2.5 mL。1～5組分別加入供試品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，6組為陰性對照組，1～6組用生理鹽水補足5 mL。7組為陽性對照組，加入蒸餾水2.5 mL。輕輕混勻反應液，置37 ℃水浴中孵育。觀察并記錄0、0.5、1、2、3、24 h溶血與凝集現象。試驗結果判斷標準：紅細胞全部下沉，上層液無色澄明，判定為無溶血；溶液澄明呈紅色或棕紅色，管底有少量紅細胞殘留，判定為部分溶血；紅色溶液澄明，管底無紅細胞殘留，判定為全溶血；溶液中有棕紅色或紅棕色絮狀沉淀，搖勻后不分散，判定為紅細胞凝聚。若藥液0.3 mL在0.5 h 內引起溶血即不宜作靜脈注射用[3-6]。

1.5 主動全身過敏反應試驗

1.5.1 致敏試驗 雙氯芬酸鈉注射液對奶牛的臨床用藥量為2.2 mg/kg·bw，經體表面積折算，豚鼠的臨床等效用藥量為28.15 mg/kg·bw[7]。本試驗中雙氯芬酸鈉注射液給藥劑量分別為50、25、12.5、6.25、3.125 mg/kg·bw。陽性對照組給予10%牛血清白蛋白-生理鹽水溶液0.5 mL/只。陰性對照組給予注射液空白溶劑。腹腔注射給藥，隔日1次，共3次[6]。

1.5.2 激發試驗 豚鼠于末次致敏后第14、21天，以2倍致敏劑量于股四頭肌快速注射進行兩次激發。觀察動物反應3 h，致敏期間每日觀察動物癥狀。

1.5.3 結果判定 豚鼠全身致敏性評價標準[3,6]：“-”，過敏反應陰性(癥狀：正常)；“+”，過敏反應弱陽性(癥狀：躁動、豎毛、顫抖、搔鼻)；“+ +”，過敏反應陽性(癥狀：噴嚏、咳嗽、呼吸急促、排尿、排糞、流淚)；“+ + +”，過敏反應強陽性(癥狀：呼吸困難、哮鳴音、紫癜、步態不穩、跳躍、喘息、痙攣、旋轉、潮式呼吸)；“+ + + +”，過敏反應極強陽性(癥狀：死亡)。計算過敏反應發生率，結合癥狀發生程度進行綜合判斷。

2 結果

2.1 溶血性試驗 試驗結果顯示，反應加液完畢后，7組即出現完全溶血現象，其他各組均為紅色不透亮液體；37 ℃水浴孵育0.5 h，5組呈現完全溶血現象；水浴孵育1 h， 4組呈現完全溶血現象；水浴孵育2 h，3組呈現完全溶血現象；水浴孵育3 h，2組呈現部分溶血現象，為紅色不透亮液體，管底有紅細胞沉淀，與生理鹽水對照組一致。4 ℃靜置過夜，1、6組上層溶液無色透明，紅細胞全部沉積到管底，振搖可分散，顯微鏡下觀察紅細胞均為單個分離，發亮，形態飽滿。其他各組均呈完全溶血現象，為紅色透亮液體，管底無紅細胞沉淀。各組均無紅細胞凝聚現象。試驗結果表明，該藥物可導致紅細胞溶解，不宜用作靜脈注射。

2.2 主動全身過敏反應試驗

2.2.1 致敏藥物劑量篩選試驗 試驗結果顯示，將10% BSA溶液以1 mL/kg·bw腹腔注射豚鼠進行3次致敏，沒有出現死亡情況。藥物劑量6.25、12.5 mg/kg·bw動物死亡率均為50%，藥物劑量25 mg/kg·bw動物死亡率為83.3%，藥物劑量50 mg/kg·bw動物死亡率為100%，藥物劑量3.125 mg/kg·bw，在觀察期內豚鼠采食飲水、行為活動、呼吸、排便等一般狀況良好，未見全身不良反應，無死亡現象。故確定該劑量為豚鼠主動全身過敏反應試驗致敏劑量，并以該劑量作為陰性對照組的致敏劑量(0.0625 mL/kg·bw)。

2.2.2 豚鼠主動全身過敏反應試驗 按照預試驗篩選出的藥物致敏劑量進行豚鼠致敏，分別于末次致敏后第14、21天，股四頭肌注射相應劑量藥物激發，觀察3 h。豚鼠行為學觀察結果顯示，陰性對照組和藥物組的豚鼠均表現為安靜正常，未出現躁動、豎毛、搔鼻、顫抖、噴嚏、咳嗽、呼吸急促等癥狀，過敏反應發生率均為0。而BSA組中有2只豚鼠可見明顯的抓鼻、顫抖、噴嚏、潮式呼吸、哮鳴音等一過性過敏反應，過敏反應發生率為33.3%。依據全身性致敏評價標準，BSA組的豚鼠呈過敏反應陽性，過敏反應程度為++。兩次激發結果顯示，出現過敏反應的豚鼠數量和反應程度均基本一致。

3 討論

注射劑和可能引起免疫性溶血或非免疫性溶血反應的其他藥物制劑均應進行溶血性試驗[6]。已有研究表明，雙氯芬酸鈉對低滲[8]、2,2′-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽介導的過氧化應激[9]導致的紅細胞溶解有較好的抑制作用，說明雙氯芬酸鈉沒有溶血性。但是由于雙氯芬酸鈉在水中的溶解度較小，達不到劑量設計濃度要求。同時，雙氯芬酸鈉分子結構中含有易被氧化的羧酸基團，在注射液中穩定性較差，因此在制劑中需添加增溶或提高穩定性的成分[10]。研究報道，雙氯芬酸鈉滴眼液溶血性較強是由于藥物中含有的聚氧乙烯(35)蓖麻油所致[11]。本試驗采用常規體外試管法檢測評價雙氯芬酸鈉注射液的溶血性[12]。試驗結果表明，雙氯芬酸鈉注射劑稀釋液在低濃度(0.1 mL)下不會導致紅細胞溶解，但是在較高濃度下可導致紅細胞溶解，且隨著藥物濃度增加，溶解紅細胞作用速度加快，溶血程度增強，因此該注射液不宜用作靜脈注射。

雙氯芬酸鈉通過與環氧化酶(COX)結合，阻斷花生四烯酸向前列腺素E2的轉化。同時可促進花生四烯酸與甘油三酯結合，降低細胞內游離的花生四烯酸濃度[12]，間接抑制白三烯的合成[13]。進而對各種發熱性、炎性疼痛性疾病發揮治療作用。然而，雙氯芬酸鈉對COX的作用為非選擇性抑制，其對COX-1的抑制作用能夠激發機體的特異性免疫應答，這也是其引起過敏反應的重要原因之一[14]。調查研究表明，在眾多NSAIDs口服藥物中雙氯芬酸類藥物引起過敏反應的比率最高[15]。本試驗結果顯示，雙氯芬酸鈉注射液不會引起豚鼠的主動全身過敏反應。陽性對照組豚鼠的過敏反應發生率為33.3%，過敏反應程度為++。對比第14天和第21天激發結果出現過敏反應的豚鼠數量一致，程度未見增強。本試驗中由于雙氯芬酸鈉注射液具有較強的溶血性，故沒有通過靜脈注射激發過敏反應，而是參考藥物的臨床給藥方式，采用肌肉注射進行激發。試驗結果的差異性是否與激發途徑有關，有待進一步研究。

4 結論

雙氯芬酸鈉注射液不會引起豚鼠主動全身過敏反應，但在一定程度上可導致紅細胞溶解，不宜用作靜脈注射。