ETEC 破壞腸上皮細胞緊密連接作用的研究進展

徐倩倩 ,郭時金 ,王玉波 ,王艷萍 ,董 林 ,王金良 ,沈志強

(1.山東省濱州畜牧獸醫研究院 山東省濱州畜禽蜂膠疫苗研究開發推廣中心,山東濱州256600 ;2.山東綠都安特動物藥業有限公司,山東濱州256600 ;3.濱州醫學院附屬醫院胸外科,山東濱州 256600)

動物腸腔內存在大量共生菌,這些細菌大部分有助于腸道功能的維持與健康[1]。然而,病原菌進入腸道就會引起感染,腸道病原菌與宿主上皮細胞的相互作用多與毒素相關。產腸毒素型大腸桿菌(ETEC)是農場動物大腸桿菌性腹瀉最常見的病原菌。ETEC 的致病性始于對宿主小腸上皮細胞的粘附,隨之而來的是腸毒素的分泌,引發急性水樣腹瀉,伴隨著炎癥和屏障功能的破壞。ETEC 能產生2類毒力因子,26 種粘附素使其在腸上皮細胞粘附和定植,3 種腸毒素引發液體分泌[2]。ETEC 產生的腸毒素與腸道上皮細胞相互作用能夠破壞腸道緊密連接,造成屏障功能障礙,水和離子以被動吸收的方式進入腸腔,引發腹瀉。

1 緊密連接的結構

胃腸道(GI)上皮細胞形成了機體與外界環境接觸的最大表面。相鄰細胞間有細胞間連接。細胞間連接的重要功能就是形成選擇性屏障[3]。腸細胞間通過4 種不同類型的連接互相結合。這些特殊的復合物包括緊密連接(Tight junctions,TJ)、粘附連接(Adherens junctions,AJ)、細胞橋粒和縫隙連接。頂端連接復合物的每個連接都是由3 個亞組件構成:跨膜蛋白、細胞骨架部分和胞質骨架蛋白。AJ 位于TJ 的底外側,由跨膜蛋白E-鈣粘著蛋白與連環蛋白家族的胞質蛋白相互作用形成。AJ 和細胞橋粒提供上皮細胞間強有力的粘合鍵,有利于細胞間信號傳導,但不參與細胞滲透性調節。TJ 具有動態結構,是轉運支路的主要屏障。

TJ 是復合蛋白結構,包括跨膜蛋白,通過它連接于細胞骨架。4 個完整的跨膜蛋白,閉合蛋白、閉鎖蛋白、連接粘附分子(Junctional adhesion molecules,JAMs)和tricellulin,形成半滲透性屏障。這些跨膜蛋白與細胞質骨架蛋白相互作用的細胞內區域,如閉鎖小帶(Zonula occludens,ZO)蛋白反過來將跨膜蛋白錨定到連接周圍肌動球蛋白環和肌動蛋白絲。胞漿蛋白將膜成分連接到細胞骨架并參與TJs 和細胞核間的信號傳導。TJs 通過細胞內支架蛋白和細胞骨架調節分子構成、超微結構和功能。在細胞培養的感染性試驗中,通常將測定跨上皮細胞電阻抗(Transepithelial resistance,TER)作為屏障功能的評價指標。屏障損壞對應著TJ 屏障空隙的增多,伴隨著可見的分子通道,如葡聚糖、甘露醇和菊糖。然而,多孔性與TER 改變并非同步。

1.1 閉合蛋白 閉合蛋白是TJ 的主要成分和支柱。閉合蛋白在多種組織的屏障形成和細胞滲透性、選擇性方面都發揮了關鍵作用。目前至少鑒定了27 種閉合蛋白[4]。閉合蛋白調節腸道上皮細胞的物質轉運。在腸道,閉合蛋白-1、-3、-5、-8、-9、-11 和-14 為屏障形成閉合蛋白,而-2、-7、-12 和-15 則是孔形成閉合蛋白。這類蛋白的高表達,會導致上皮細胞更加緊密、TER 增高、上皮細胞單層的不滲透性增強。閉合蛋白嚴格控制了陽離子和陰離子跨細胞流動。相鄰細胞間的閉合蛋白,有的能夠形成細胞間連接,而有些則不能。它們對于TJs 的屏障功能尤為重要。一些閉合蛋白是磷酸化的,磷酸化程度與其在細胞的定位和細胞滲透性有關。

1.2 閉鎖蛋白 閉鎖蛋白是一種完整的膜TJ 蛋白,呈現4 個跨膜域。閉鎖蛋白從TJ 向細胞質囊泡的移動通常會導致屏障功能丟失改變上皮細胞通透性。閉鎖蛋白在TJ 結構和腸上皮細胞屏障功能維持中發揮重要作用。閉鎖蛋白在TJ 內一般是磷酸化狀態,而在基底外側膜和胞漿中磷酸化狀態則較為少見。閉鎖蛋白長長的C-端域與多種細胞內TJ 蛋白相互作用,如ZO 蛋白,將閉鎖蛋白連接到肌動蛋白細胞骨架上[5]。閉鎖蛋白在TJ 結構和腸上皮細胞滲透性方面都發揮了重要作用,細胞外環與鄰近細胞相互作用,形了能阻擋大分子但不能阻擋小離子的屏障。

1.3 JAM JAM 家族屬于免疫球蛋白(IG)超家族,其特點為細胞外IG 域,1 個跨膜域和1 個細胞外域。JAS 參與多種功能,包括TJ 組裝、內皮細胞及上皮細胞轉運通透性調節[4]。

1.4 ZO 目前已鑒定了3 種ZO,包括ZO-1,ZO-2和ZO-3[4]。它們是細胞漿蛋白,為TJ 結構的調整和維持所必須。ZOs 屬于膜相關鳥苷酸激酶蛋白大家族。ZOs 在TJ 的細胞質側形成一種復合物。ZO-1 位于上皮細胞和內皮細胞TJ 等離子膜附近,與激動蛋白細胞骨架相互作用。ZO-2 和ZO-3 為外周蛋白,是ZO-1 的結合蛋白。許多TJ 蛋白結合于ZO蛋白N-末端區域,而C-末端區域與肌動蛋白細胞骨架相互作用。在細胞培養和動物模型中,ZO-1 都是位于初期細胞間的連接。據推測,ZO 蛋白可能介導TJ 蛋白的初期裝配并形成細胞間連接。

1.5 Tricellulin Tricellulin 是在3 個相鄰細胞間形成連接的TJ 蛋白。Tricellulin 是一種四分子交聯體蛋白,有4 個跨膜域和2 個細胞外環。研究發現,Tricellulin 在三細胞連接和兩細胞連接的上皮細胞TJ 調節中都發揮了重要作用。

1.6 肌動蛋白 肌動蛋白細胞骨架的結構對TJ 的功能至關重要。肌動蛋白細絲對于維持細胞形狀和上皮細胞屏障的完整性都非常重要。在極化細胞,頂端區域含有大量肌動蛋白微絲,它們以多種結構存在。肌球蛋白和肌動蛋白形成一個環(連接周圍肌動蛋白肌球蛋白環),從TJ 和AJ 水平將細胞環繞[6]。

2 ETEC 腸毒素對TJ 的破壞

腸毒素是致病性微生物產生的蛋白或者肽,作用于消化道,特別是小腸上皮細胞,破壞其TJ 結構,導致柵欄和門控功能失效。主要產生熱不穩定性毒素(Heat-labile toxin,LT) 和熱穩定性腸毒素(Heat-resistant,ST)。ST 是低分子量毒素,能夠耐受100 ℃15 min,而LT 在60 ℃15 min 即可失活。這2 種毒素都是質粒編碼,并且毒力特性可在大腸桿菌菌株之間轉移[7]。這些分子具有非常強的毒性,納摩級濃度甚至更低即可引起腸道穩態的破壞。ETEC 菌株造成的感染,表現為上皮細胞通透性屏障破壞,很難將這種破壞直接歸因于一種或幾種腸毒素,但卻都與K88 血清型有關[8]。

Egberts 等發現3 周大的仔豬人工感染ETEC(O145、K91、K88),與未感染的空白對照組相比,豬空腸上皮細胞TJ 數量明顯減少,TJ 鍵的排列變得松散,但對辣根過氧化物酶(MW=44 kDa)的通透性沒有發生變化,說明盡管連接的鍵數量減少,TJ的屏障功能沒有受到影響。也有研究發現,仔豬感染ETEC 后,小腸對小分子的通透性增加,絨毛變短,隱窩加深,空腸閉鎖蛋白、ZO-1 和ZO-2 以及回腸閉合蛋白-1、ZO-1 和ZO-2 表達減少[9-10]。相反,Roselli 等[11]通過測定人Caco-2 細胞TER 發現,豬ETEC 株(K88)降低TJ 通透性,使ZO-1 移位,并降低豬IPEC1 腸道上皮細胞閉鎖蛋白的豐度。

2.1 LT LT 是AB5 型高分子量毒素(大約85 kDa)。它在結構、功能和作用機制方面與霍亂毒素(Cholera toxin,CT)都十分相似。LT 全毒素由一個酶促激活A(30 kDa)亞單位(ADP-ribosylating)結合于5 個受體結合B(11.5 kDa)亞單位構成。A 亞單位包括含有活化位點的A1 片段和將A1 結合于B亞單位的A2 片段。LT-B 亞單位的受體在腸細胞廣泛存在,包括GM1 神經節苷脂、GD1b,去唾液酸GM1、一些乳蛋白和含半乳糖糖脂。GM1 神經節苷脂是LT-1 的首選受體。LT-1 通過B 亞單位與受體結合后,A 亞單位通過受體介導的內吞作用內化進入細胞。通過逆行轉運,轉運至高爾基體和內質網(Endoplamic reticulum,ER)。在高爾基體解體后,A亞單位轉移到ER,在此被剪切為A1 和A2 兩份。A1 片段轉移到胞液,導致腸細胞基底側膜腺苷酸環化酶激活[5]。腺苷酸環化酶的激活導致細胞內cAMP 蓄積,以及囊纖維化跨膜調節因子(Cystic fibrosis transmembrane regulator,CFTR)的活化,伴隨著蛋白激酶A(Protein kinase A,PKA)磷酸化。Cl-和HCO3-從這個開放的通道分泌。同時,PKA 通過鈉氫交換體3(Na+/H+-exchanger 3,NHE3)磷酸化抑制Na+被絨毛細胞再吸收。滲透壓作用導致水分泌增多,引發腹瀉。LT-1 的作用是不可逆的,可以被抗CT 抗體中和。

LT 對不同細胞株可能表現為不同的作用。豬ETEC 菌株明顯降低IPEC-J2 細胞的TER,未見TJ蛋白(ZO-1,ZO-2,ZO-3、閉合蛋白、閉鎖蛋白和JAMS)表達或者分布有明顯改變。推測TER 的改變可能歸因于ETEC 對宿主離子通道功能的作用而不是TJ。ETEC 菌株與極化T84 上皮細胞單層共培養3 h 可引起TER 下降[12],對于產LT 菌株,這種現象感染后48 h 出現逆轉,而在產STa 菌株則未出現。LT 腸毒素不僅通過破壞TJ 引起T84 細胞單層TER 下降,還導致葡聚糖-FITC(4 kDa)通道破壞。弗斯可林(cAMP 誘導物)處理缺乏葡聚糖通道細胞說明LT 通過一種非cAMP 依賴性途徑引起對大分子的通透性。ADP -核糖基活性降低、LT-B 亞基減少突變證實TER 降低僅出現在單層細胞受功能性LT 腸毒素處理或者產LT ETEC 菌株處理后,伴隨著對FITC-葡聚糖通透性的增高。數據顯示,產LT ETEC 菌株誘導腸道通透4～67 kDa 分子的屏障功能障礙,該作用依賴于LT ADP-核糖基活性。

2.2 ST STs 是一類由一些大腸桿菌菌株產生的低分子量微粒。ETEC 主要產生兩類ST,為STa 和STb。STa 主要與人類腹瀉有關,STb 在人類腹瀉病例中也有分離到,但主要引起動物腹瀉,特別是豬腹瀉[13]。

2.2.1 STa STa 是一種18-(豬STa)或者19-氨基酸(人STa)富含半胱氨酸肽,分子量大約2 000 Da。2 個亞類的氨基酸序列不同,但兩者都含有3 個二硫鍵。二者在仔豬體內都有活性?？偲饋碚f,從氨基端半胱氨酸到羧基端半胱氨酸13 個氨基酸序列是其毒性的關鍵。STa 結合于腸道上皮細胞刷狀緣絨毛的糖蛋白受體鳥苷酸環化酶C(Guanylate cyclase C,GC-C)的細胞外區域。結合后,GC 細胞內催化位點激活,導致cGMP 產生,并在細胞內聚集。cGMP 水平增高激活cGMP 依賴性蛋白激酶Ⅱ,使得Cl-通道CFTR 磷酸化。CFTR 激活,導致Cl-和HCO3-分泌。cGMP 增高還會抑制磷酸二酯酶3(Phosphodiesterase 3,PDE3),增高了cAMP 水平,激活PKA。PKA 使CFTR 磷酸化,還可以使NHE3 磷酸化,抑制Na+的再吸收[13]。STa 的作用是可逆轉的。

STa 腸毒素與鳥苷酸,一種生理性的GC 激活劑,呈現相似的作用。STa 在4 μM 以上的濃度,培養2 h 即可造成T84 上皮極性細胞單層TER 的降低,但鳥酐蛋白卻不能;然而,利用FITC-葡聚糖(4 kDa)的轉運通道測定進行評價時,STa 或者鳥酐蛋白均不能增加細胞通透性,說明STa 不僅增加水分泌,還會破壞屏障功能[14]。因為TER 下降的部分,濃度都在4 μM 以上,說明STa 引發TER 下降僅出現在有限的上皮細胞位點,可能是ETEC 粘附并且產生STa 毒素的位點。數據顯示STa 通過GC-C激活引發水分泌,同時在誘發腸道屏障障礙中也發揮了作用。STa 對TER 的作用研究雖然較少,但它可能在ETEC 的發病機理中占重要作用。

2.2.2 STb STb 為48 個氨基酸的肽,分子量為5 200 Da,2 個二硫鍵。這類毒素的序列和作用機制均與STa 無關。STb 無需激活腺苷酸或者GC 即可引發腹瀉。它與腸道上皮細胞的鞘糖脂,硫苷脂結合。STb 與其受體的結合引發內吞作用,使其內化。一旦進入細胞,STb 即可激活GTP 結合調節蛋白,Ca2+被攝入到細胞,激活CAMKⅡ,一種鈣調蛋白依賴性蛋白激酶。該酶使CFTR 磷酸化,引發Cl-和HCO3-分泌。細胞內Ca2+水平增高還可激活蛋白激酶C(Protein kinase C,PKC),這種酶也作用于CFTR,并通過一種尚不明確的通道抑制Na+吸收。CAMKII 還能打開鈣激活氯離子通道(Calcium-activated chloride channel,CaCC)。同時,Ca2+水平的最初升高通過磷脂酶A2 和C 活化刺激膜脂促分泌素前列腺素E2(Prostaglandin E2,PGE2)合成。在腸嗜鉻細胞內,這些酶產生 5-羥色胺 (5-hydroxytryptamine,5-HT)。5-HT 作用于腸道神經系統,使腸壁平滑肌收縮,造成液體的排出。這些改變導致十二指腸和空腸分泌水和電解質。STb 的作用是可逆的。

單獨用STb 毒素處理T84 極化細胞單層,能引起TER 顯著降低,而單個氨基酸突變(D30V)無生物學活性的肽則不能降低[15]。轉運通透性的增加與F-actin 張力纖維的巨大改變有關。共聚焦顯微鏡觀察發現,F-actin 細絲溶解和縮合伴隨著ZO-1,claudin-1 和閉鎖蛋白的重排和/或分裂。該結果與STb 中一段8 氨基酸肽處理細胞一致,也與霍亂弧菌Zot 毒素作用后一致,但與T84 細胞受雜亂肽處理結果不同。這個8 肽負責與STb 和Zot 毒素受體結合。對于Zot 毒素,該8 氨基酸序列還參與TJ 重排。因此,STb 引發TJ 開放,表現為TER 明顯下降,細胞對大分子量標記物(FITC-BSA=47 kDa)通透性增加,與其導致TJ 蛋白重新分布和肌動蛋白細胞骨架重排有關。采用免疫印跡和共聚焦顯微鏡觀察,發現STb 處理后T84 細胞單層claudin-1 的重新分布[16],從膜轉移到細胞液中。同時,Dreyfus 等推測了鈣在STb 活性機制中的作用,在細胞培養基中增加Ca2+后,屏障功能的破壞速度明顯增加。膜claudin-1 的消失伴隨著去磷酸化?？傊?STb 處理導致claudin-1 在細胞的重新分布,從細胞膜轉移到細胞質位點。TJ 膜claudin-1 磷酸化的消失可能導致了滲透性的增加。STb 通過改變TJ 蛋白造成上皮細胞屏障破壞,最終導致腹瀉。

3 展望

ETEC 是引發人類和幼畜腹瀉的重要原因。ETEC 產生各種LT 和ST 腸毒素通過對腸道上皮細胞TJ 產生破壞作用。很明顯,除了對離子通道的活性作用,毒素還影響到上皮細胞的通透性。在ETEC 感染引發水樣腹瀉中,ETEC 引發的TJ 破壞到底發揮了怎樣的角色仍需進一步研究。從控制腸離子通道和保護TJ 的角度預防和治療ETEC 引發的腹瀉無疑也是一個突破點。