牛乳中主要過敏原致敏機理及其脫敏技術的研究進展

王佳蕊，李朝旭，李書國

（1河北科技大學生物科學與工程學院，石家莊050018，2河北三元食品有限公司，河北新樂050070）

0 引 言

牛奶富含蛋白質及多種礦物質，俗稱“白色血液”，但它也是一類容易引起過敏的食物，在兒童中發病率大約為0.3%～7.5%，在成年人中的發病率則小于1%[1]。食物過敏是由某種食物或食品添加劑等引起的IgE介導和非IgE介導的免疫反應，可導致消化系統或全身性的變態反應。在嬰幼兒成長階段，母乳是其食物來源的最佳選擇，但一些母親由于身體狀況無法正常提供母乳，所以奶粉就成為母乳唯一替代品。但是，近些年由于生活方式的改變、微生物的暴露、飲食習慣的改變等多種因素，嬰幼兒的腸道免疫功能越來越低下，越來越多的嬰幼兒患有牛乳蛋白過敏，這對他們的生活和家庭都帶來極大的不便。

牛乳蛋白過敏(cow milk protein allergy，CMPA）是指由牛奶蛋白引起的異常或過強的免疫反應，母乳喂養的嬰兒也可能發生牛奶蛋白過敏，是最普遍的一類食物過敏，發病率約為2%～7.5%[2]，主要存在于2歲以下的兒童中[3]。一般情況下，特應性皮炎是嬰幼兒CMPA的主要表現形式。特應性皮炎是一種慢性反復，伴有瘙癢的皮膚病，蕁麻疹為常見的表現形式。58%CMPA患兒可出現早期反應，表現為蕁麻疹、血管性水腫、嘔吐或急性特應性皮炎；42%的患兒會出現遲發性的胃腸道反應[4]，例如腹痛、腹瀉等。這些癥狀極大影響了嬰幼兒的營養吸收和生長發育，同時對家庭也造成了嚴重的困擾。目前對于這種癥狀還沒有一套很完善的治療方案，所以為了嬰幼兒的健康成長，脫敏方法有待進一步提高，脫敏乳粉的開發也是迫在眉睫。

1 牛奶過敏原以及發病機理

能夠引起食物過敏的物質叫做過敏原。食物中常見的過敏原大多都是蛋白質類物質，牛奶中含有超過20種的蛋白質，這些蛋白質都可能作為過敏原導致過敏反應[5]。目前，大多數牛乳過敏患者均是由特異性IgE介導的變態反應，一般要依次經歷致敏階段和效應階段兩個過程。當一種物質進入人體后，它通常會被降解，過敏原與抗原呈遞細胞結合組成復合物，在過敏原刺激下，漿細胞產生大量過敏原特異性IgE抗體。過量的IgE能和一種含有多種過敏遞質的肥大細胞結合，當再次接觸到過敏原時，食物蛋白就會和附著在肥大細胞上的IgE發生反應，刺激肥大細胞釋放出組織胺等化學物質，引起毛細血管擴張、血管壁通透性增強，引發過敏。

經研究表明，CMPA主要致病原因是由乳糖中的αs1-酪 蛋 白（αs1-casein，αs1-CN）、α-乳 白 蛋 白（α-lactalbumin，α-La）和β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-Lg）作為常見過敏原而引起的[6]，這些蛋白都含有可以被免疫系統識別的抗原表位，包括構象表位和線性表位[7]。

1.1 αs1-酪蛋白

酪蛋白之所以是過敏原，是因為人乳與牛乳酪蛋白的組成和含量不同及其成分結構上的差異[8]。牛乳酪蛋白膠束粒子顆粒大，且沉淀時呈堅硬的凝塊，而人乳中的酪蛋白膠束粒子較小，而且沉淀時呈極細微的分散狀態。凝固性是由于牛乳中大量存在的αs-酪蛋白引起的，該物質在牛乳中占60%左右，其中80%是αs1-酪蛋白，但是人乳酪蛋白中幾乎不含αs-酪蛋白。

αs1-酪蛋白是酪蛋白中最主要的一個過敏原，凡是對酪蛋白過敏的人，基本上都對αs1-酪蛋白過敏[9]。它是由分子間疏水相互作用形成非剛性三級結構，含有199個氨基酸，主要抗原表位在123～132，69～78[10]。

1.2 α-乳白蛋白

牛乳α-乳白蛋白是由123個氨基酸組成的球形單體蛋白[10]，與人乳α-乳白蛋白相比，有74%的氨基酸相同，另外有6%的氨基酸殘基化學性質相似，但目前也是公認的引發牛乳過敏的主要過敏原之一，這表明其構象表位是牛乳過敏的主要原因[11]。已有研究表明，有75%的牛乳過敏患者血清中含有α-乳白蛋白的特異性抗體[12]，其主要抗原表位在42～49，60～80，91～96。

1.3 β-乳球蛋白

β-乳球蛋白含有162個氨基酸殘基，存在形式與pH值有關，在鮮牛乳中通常是二聚體形式存在[10]。由于人乳中不含有β-乳球蛋白，因此它被認為是最主要的牛乳過敏原蛋白之一。另有研究證明，82%的牛乳過敏患者對牛乳β-乳球蛋白過敏[13]，其主要抗原表位在41～60，102～124，149～162。

2 食物脫敏的方法

在食品加工過程中，有許多可以降低或者去除過敏原的方法[14]。根據食物不同的過敏機理、過敏原的一些結構與性質，國內外普遍采用的脫敏方法有三種：物理、化學和生物學方法。物理方法主要包括熱處理、輻照處理以及高靜水壓處理；化學方法主要是糖基化修飾；生物學方法主要有發酵法、基因工程法和酶法。

2.1 物理方法

2.1.1 熱處理

蛋白質變性是結構構象發生改變，一般是二、三、四級結構的變化。熱處理可導致蛋白質的變性，導致構象產生不可逆的變化，從而影響其物理化學性質。熱處理可以將許多蛋白質分子中的作用鍵打開，將被卷曲的肽鏈釋放出來，可加速蛋白酶的水解和消化酶的分解[15]，并且有利于降低蛋白的致敏性。由于過敏反應中B細胞的抗原決定部位取決于其構象和抗原的三級結構，因此熱變性主要改變B細胞的過敏反應模式[16]。

Bu等[17]研究了牛乳過敏原β-Lg的熱誘導抗原性變化，結果表明加熱至90℃時會導致β-Lg分子展開、構象表位暴露，對蛋白水解的敏感性增強，從而導致過敏反應的增加。但是進一步升高溫度至100℃和120℃可掩飾或者破壞構象表位并降低變應原性。這種熱誘導的變化顯示出對消化性水解的更高敏感性[18]。蛋清可以作為嬰幼兒優良食品之一，但同時也是食物過敏原之一。Lechevalier等[19]對蛋清粉在70°C下2-5 d或80～90°C下1-2 d進行干熱處理，結果表明干燥加熱也會改變卵白蛋白構象，降低抗原性和免疫原性，同時還改善了蛋清的起泡性和凝膠性等功能特性。除此之外，Sanchiz等[20]采用濕熱結合高壓的方法研究了對腰果和開心果IgE反應性的影響，在2.56 ATM，138°C條件下處理這兩種樹堅果30 min，結果表明與未處理的腰果相比，交聯IgE和嗜堿性粒細胞的能力顯著降低了，明顯降低了過敏性。這一系列研究表明，熱處理可以改變致敏蛋白的結構性質從而在一定范圍內降低食物的致敏性，但具體在實際生產中的應用效果還需要進一步研究。

2.1.2 輻照處理

食品輻照技術是使用電離輻射源60Co或137Cs產生的γ射線、機械源產的X射線或電子束對將包裝或散裝食品置于受控水平下電離輻射一定時間的處理過程[21]。輻照技術其實就是利用射線與物質間的作用，電離和激發產生的活化原子、活化分子與物質發生一系列物理、化學、和生物化學變化，導致物質的降解、聚合、交聯、并發生改性。有研究表明經處理后蛋白質分子會發生脫氨、脫羧、氨基酸氧化、二硫鍵斷裂或重建、肽鏈的降解或交聯等一系列的反應[22-23]，改變蛋白分子原有的性質，進而達到降敏的效果。

輻照處理在牛奶中研究較少，但在其他食物脫敏方面應用廣泛。Luo等[24]選用1、3、5或10 k Gy劑量輻照花生全蛋白提取物，結果表明輻照使花生過敏原Ara h 6的二級和三級結構發生顯著變化，隨著輻照劑量的增加，花生全蛋白提取物的抗原性有所降低。Gomaa[25]等研究了γ射線輻照和熱處理對面包、煮面條和膨化谷物的回收率影響，結果表明γ射線輻照可能影響低水平致敏食品殘留的抗原性，不過這也取決于食品基質和加工方法。綜上考慮，輻照處理在乳制品脫敏方面需要更加深入研究，并且其安全性也有待考察。

2.1.3 高靜壓處理（High hydrostatic pressure，HHP）

在一個壓力條件下維持一定時間的稱作靜壓力，食品加工應用中的一般壓力范圍在100～1 000 MPa[26]。高靜壓技術是一種新興的食品工業非熱技術，可以抑制微生物的生長，延長食品的貨架期，但不影響食品感官特性。高壓處理蛋白質主要通過三條途徑降低其致敏性，一是高壓誘導蛋白質聚合，從而掩飾或破壞表位；二是通過提取來去除過敏原；三是壓力誘導蛋白展開使蛋白酶在其中作用達到降敏效果。其實主要是影響蛋白質分子中的非共價的相互作用，例如氫鍵、離子鍵和疏水鍵，從而影響二級和三級結構，達到調節其消化率和變應原性效果[27]。

Hu等[28]使用HHP多循環裝置處理密封在聚乙烯塑料袋中α-氯化萘樣品，以未加壓α-氯化萘為對照，結果表明HHP處理的α-酪蛋白組表現出不同程度的降解，這可能與特征結構域的破壞以及構象的改變有關。Yang等[29]研究了高壓結合熱處理對核桃免疫反應的影響，在650 MPa、100℃下處理15 min后，IgE結合能力大幅下降，同時表征了加工核桃對BALB/c小鼠過敏模型的影響，其血清特異性IgE結合能力和組胺水平分別下降41.04%和19.76%，表明小鼠過敏反應的臨床癥狀明顯減輕。結果表明HHP和熱處理聯合應用可能是減少食物過敏原的一種潛在策略。

2.2 化學方法

糖基化修飾是將碳水化合物以共價鍵與蛋白質分子上的氨基相連接而形成糖基化蛋白的化學反應[16]，又稱美拉德反應。糖基化過程誘導變應原蛋白發生可逆或不可逆的結構修飾，導致蛋白變性、聚集，從而食物蛋白的過敏行為可能被減弱，最終降低其致敏性。除此之外，糖化反應可產生高級糖化終產物，其可消除抗原呈遞細胞的抗原性，并因此抑制過敏反應[30]。

田明等[31]用高壓脈沖電場和糖基化復合處理β-Lg，結果表明自由基含量顯著下降，β-Lg的表位被遮蓋，并且在15 kv/cm下在進行糖基化處理，降敏性程度最大。Gupta等[32]研究了糖化對食物蛋白致敏性的影響，將鷹嘴豆蛋白純化，隨后再將該純化蛋白糖化，與天然蛋白處理相比，結果表明在糖化蛋白處理的小鼠中，暴露的脾細胞中產生的Th1多于Th2，顯然鷹嘴豆過敏原的糖基化顯著降低了小鼠的致敏潛能和過敏反應，并且這項研究可能對臨床有益。

2.3 生物學方法

2.3.1 微生物法

腸道菌群失衡的人群更容易食物過敏，嬰幼兒的過敏癥狀主要也是由于腸道菌群失調引起的。有研究表明過敏嬰幼兒與非過敏嬰幼兒相比，腸道乳酸桿菌、雙歧桿菌定植較少[33]。因此，腸道環境對食物過敏的形成起重要作用，腸道微生物的穩定對免疫系統的成熟有著重要的作用。所以，乳酸發酵可以作為降低牛乳蛋白過敏的一種方法。

Pescuma等[34]選取保加利亞乳桿菌CRL 656降解β-Lg，結果表明乳桿菌細胞包膜蛋白酶能夠在體外降解β-Lg及其表位，降低人體內血清對該蛋白的過敏反應。Shi等[35]研究了干酪乳桿菌發酵對α-La、β-Lg、α-酪蛋白和β-酪蛋白抗原性和殘留致敏性的影響，結果表明發酵后明顯降低了4種乳蛋白的抗原性和致敏性。由此可見，微生物法可有效降低食物的致敏性，目前也受到越來越多人的關注，但微生物發酵抗過敏機制尚未十分清楚，特別是對降低致敏蛋白過敏性的效果尚沒有明確的結論[36]。

2.3.2 酶解

大部分食物過敏原都是蛋白質，蛋白酶催化蛋白質具有表位的片段，進行水解可顯著降低蛋白質抗原性，防止蛋白質類過敏的發生[27]。牛乳中主要是以酪蛋白、乳清蛋白為主的過敏原，將其水解為沒有過敏性的小分子乳蛋白、乳蛋白肽或者氨基酸，從而降低牛乳的過敏性。

Damodaran等[37]用兩步酶法影響乳蛋白的免疫反應性，用嗜熱菌蛋白酶、胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶進行初始部分水解，隨后使用谷氨酰胺轉胺酶使水解產物再聚合。結果表明嗜熱菌蛋白酶是破壞乳清蛋白中變應原表位最有效的蛋白酶，并且免疫原性大幅下降，即兩步酶促修飾方法可以生產低變應原性乳蛋白質產品。Villas-Boas等[38]模擬胃腸道消化的抗性β-Lg進行兩步酶促修飾，研究了堿性蛋白酶和菠蘿蛋白酶水解β-Lg及其與轉谷氨酰胺酶聚合反應對蛋白質抗原性的影響，結果表明堿性蛋白酶水解比菠蘿蛋白酶水解能更有效地裂解β-Lg表位，降低IgE結合反應。通過研究得到適當酶解可以改變乳蛋白性質，降低IgE的結合能力，從而達到牛乳脫敏的效果，這項研究對CMPA患兒有一定的幫助。

除此之外，酶解在其他具有過敏原的食物中也有降敏作用。Meinlschmidt等[39]也采用食品級蛋白酶對大豆分離蛋白中主要過敏原進行酶輔助還原，結果表明堿性蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶的水解活性分別為100%、100%和95.9%，這3種酶對大豆主要過敏原的降解效果最好。Ambrosi等[40]將HHP與酶水解方法結合處理乳清蛋白濃縮物，在不同壓力水平和時間下進酶解，觀察其蛋白質致敏性，結果表明當這兩種方法結合使用時，水解度隨著施加的壓力水平和處理時間增大而增大，影響蛋白質的致敏力。從該實驗中又能得到單獨使用HHP對蛋白質抗原性沒有顯著影響，但結合酶法，隨著壓力增大蛋白質解折疊最大化，蛋白質暴露于蛋白水解酶的攻擊，使之變性誘導肽鍵斷裂，從而影響其抗原力。酶水解可以作為降低變應原性水平的有效途徑，但是酶解可以將蛋白質水解為沒有致敏性的氨基酸，達到完全脫敏的效果，但若進行部分水解為混合肽，還是存在潛在的過敏性。目前來看酶法結合其它脫敏方法降敏的效果可能更加顯著，但能夠完全脫敏的方法還是很少，還需要我們進一步研究。

3 國內外抗過敏乳粉的應用現狀

目前國內外大多都是用酶解方法來緩解嬰幼兒牛奶過敏癥狀，基本大多選用水解配方奶粉代替普通奶粉進行喂養。根據水解程度的不同，有深度水解產品、部分水解產品和輕度水解產品。國外有推薦深度水解配方奶粉作為嬰兒病例的替代品，然而該配方奶不僅被反映口感較差，而且有研究表明出現了營養問題，如嬰幼兒生長減少，血漿蛋白濃度和鐵結合能力降低，血漿和尿液中某些氨基酸濃度失衡等問題[41]。

目前部分水解牛奶配方奶對患有輕中度特應性皮炎的嬰兒具有明顯的治療效果。Jin等[42]研究了大多數CMPA患者是否能攝入水解配方的奶粉，對53例患有牛奶過敏的兒童每20 min進行一次口服激發試驗，即連續攝入8 mL/kg體重的部分水解配方乳粉，統計分析得到有40名兒童沒有任何不良反應，結果表明早期和長期施用部分水解配方乳粉可以有利于誘導牛奶過敏患兒對牛奶抗原的免疫耐受。Bhanegaokar等[43]研究了益生菌鼠李糖乳桿菌GG(Lactobacillus rhamnosus GG，LGG)的廣泛水解酪蛋白配方（extensively hydrolyzed casein formula，EHCF）是否可以減少牛奶過敏患兒其他過敏表現的發生。結果表明EHCF+LGG配方降低了其他過敏表現的發病率，加速了IgE介導CMPA患兒口服耐受的發生，這表明微生物法與酶解法聯合脫敏效果顯著。張菊弟等[44]選取98例牛奶蛋白過敏性哮喘患兒進行人工喂養深度水解配方奶粉12周，結果表明體重指數和IgE相比治療前分別有明顯的提高和下降。該配方奶粉治療過敏性哮喘效果顯著，可用于臨床醫學的推廣。鄒素娟等[45]將50例牛奶蛋白過敏性腹瀉患兒一半攝入游離氨基酸配方奶粉，一般攝入深度配方水解奶粉，觀察患兒腹瀉次數、大便性狀等，結果得到深度配方奶粉治療腹瀉的總有效率可達100%。綜上所述，酶解方法應用于牛乳脫敏較普遍，大多數水解配方奶粉可以緩解牛奶過敏癥狀，但還需要進一步研究保證最大限度的脫敏以及改善產品的口感。

目前國外的雀巢、雅培和美贊臣都注冊了水解配方奶粉。雀巢推出的深度水解恩敏舒和部分水解肽敏舒系列產品，以及美贊臣研發的安敏健，都是針對CMPA患兒開發的無過敏性或低過敏性的配方乳粉。我國是近幾年才開始著重研究水解配方乳粉對嬰幼兒的影響，不過目前我國在抗過敏奶粉方面還是零產品，與國外差距甚大。

4 結論與展望

牛乳過敏是全世界普遍關注的食品安全問題，它不僅影響嬰幼兒生長發育，而且對家庭無疑也是一種負擔，所以目前功能性乳制品的開發迫在眉睫，我們必須重視該問題，并深入探究過敏機理以及脫敏方法。

關于乳制品的降敏技術，物理和化學脫敏主要是改變蛋白的結構特性，在一定程度上降低牛乳過敏性，但能否可以應用到實際生產中還有待研究；微生物法是當下脫敏技術的一個新的選擇，不影響牛乳本身的營養價值與風味，具有潛在的應用前景；酶解可以最大限度降敏甚至完全脫敏，但是口感方面可能會有所欠缺。目前已知的深度水解配方將蛋白質水解為氨基酸，雖然沒有致敏性但是口感和功能特性上遠不如部分水解配方奶粉。部分水解不僅能降敏，還能釋放出小分子量功能肽，可以改善嬰幼兒睡眠質量并提高免疫力。綜合考慮，在降低牛乳蛋白過敏方面，部分水解蛋白和微生物發酵都是不錯的方法。除此之外，也可以考慮多種方法聯合降敏，這就需要我們進一步在理論和實際應用方面研究，相信未來的技術越來越先進，產品無論在口感還是療效，都將會有重大突破。