酶聯(lián)免疫法檢測(cè)奶粉樣本中的乳鐵蛋白及其均勻度的探索

鄭云鵬，趙紅杰，郭靖宇，呂肖楠

（飛鶴（龍江）乳品有限公司，黑龍江龍江161100）

0 引 言

乳鐵蛋白（Lactoferrin，LF）是一種具有免疫功能的鐵結(jié)合性糖蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量約為80 ku，具有抗菌性，抗病毒性，抗癌作用[1]。LF初乳中含量最高，另外在外分泌液（乳汁、唾液、淚液、鼻分泌物）、血漿、羊水、子宮分泌物和尿液中也含有LF[2]。

《乳鐵蛋白人群健康效應(yīng)專家共識(shí)》指出攝入一定量從牛乳中分離提取的乳鐵蛋白，有助于改善嬰幼兒營(yíng)養(yǎng)狀況，能夠降低嬰幼兒腹瀉、新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎、呼吸道疾病、新生兒敗血癥等疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[3]。目前，乳鐵蛋白已作為食品添加劑被廣泛應(yīng)用于嬰幼兒配方奶粉及各種功能性食品中。乳鐵蛋白的檢測(cè)方法有有酶聯(lián)免疫吸附法、免疫擴(kuò)散法、放射免疫法和高效液相色譜法[4-5]。高效液相色譜法和酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)是常用的檢測(cè)方法，但其前處理繁瑣，且無(wú)法除去生乳中其他雜質(zhì)對(duì)于乳鐵蛋白測(cè)定的干擾，免疫擴(kuò)散法操作簡(jiǎn)單，能夠快速檢測(cè)嬰兒配方奶粉中乳鐵蛋白含量[6]。通過(guò)優(yōu)化ELISA試劑盒樣本前處理方法，并檢測(cè)不同采樣點(diǎn)的樣本值，以期驗(yàn)證試劑盒的驗(yàn)證該試劑盒的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，及檢驗(yàn)?zāi)谭蹣颖局腥殍F蛋白的均勻性，為乳鐵蛋白含量檢測(cè)的的相關(guān)人員提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

乳鐵蛋白酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒（Vitest，北京納百生物科技有限公司）；MK3酶標(biāo)儀（Thermo）；分析天平（Sartorius）；移液器(RAININ 200、1000μL)；本公司批次不同奶粉樣本。

1.2 方法

1.2.1 試劑盒檢測(cè)原理

試劑盒基于酶聯(lián)免疫原理，采用間接競(jìng)爭(zhēng)的方法，樣本吸光度值與其所含乳鐵蛋白的含量成負(fù)相關(guān)，可定量檢測(cè)奶粉樣本中的乳鐵蛋白含量。

1.2.2 ELISA試劑盒操作步驟

（1）將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，恢復(fù)至室溫，注意每種液體試劑使用前均須搖勻；

（2）樣品前處理：稱取0.1±0.005 g奶粉樣本至2 mL EP離心管中，加入1 mL 1×樣本稀釋液溶解，用渦旋儀渦旋至完全溶解，樣本最終稀釋2000倍，待檢；

（3）板孔及樣本編號(hào)：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置；

（4）加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本和抗體工作液：加入標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50 L到對(duì)應(yīng)的微孔中，然后加入抗體工作液50 L/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37℃避光環(huán)境中反應(yīng)30 min；

（5）洗板：小心揭開(kāi)蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，加入洗滌工作液250 L/孔，充分洗滌4～5次，每次間隔10 s，潑掉板孔內(nèi)洗滌液，用吸水紙拍干；

（6）加酶標(biāo)二抗：加入酶標(biāo)二抗100 L/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37℃避光環(huán)境中反應(yīng)30 min，取出重復(fù)洗板步驟5；

（7）顯色：加入TMB底物液100 L/孔，用蓋板膜蓋板后置37℃避光環(huán)境中反應(yīng)15 min；

（8）測(cè)定：加入終止液50 L/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450 nm處測(cè)定每孔OD值，使用軟件（4參數(shù)法）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算樣品中乳鐵蛋白的含量。

1.2.3 試劑盒方法的準(zhǔn)確性驗(yàn)證

選取乳鐵蛋白陰性樣本進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)，添加濃度分別為30，80，100，和140 mg/100g。

1.2.4 試劑盒方法的可行性性驗(yàn)證

選取含有乳鐵蛋白的8種奶粉樣本進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5 樣品前處理方法優(yōu)化

取4 g樣本至50 mL離心管，加入40 mL去離子水稀釋至10倍，再用去離子水稀釋至100倍被，最后用1×樣本稀釋液稀釋至和2000倍，待測(cè)。

1.2.6 不同采樣點(diǎn)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

選擇4種奶粉樣本，每種樣本選擇3種不同的采樣點(diǎn)，采用優(yōu)化后前處理方案，進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.7 改良工藝后檢測(cè)奶粉樣本中乳鐵蛋白的均勻度

使用改良后的工藝，混合乳鐵蛋白。選擇4種樣本，每種樣本選擇3種不同的采樣點(diǎn)，采用優(yōu)化后前處理方案，進(jìn)行檢測(cè)

2 結(jié)果與分析

2.1 試劑盒方法的準(zhǔn)確性驗(yàn)證

配置一定濃度的乳鐵蛋白工作溶液添加至乳鐵蛋白陰性樣本中，使其終濃度為30、80、100、和140 mg/100 g。檢測(cè)結(jié)果顯示：標(biāo)準(zhǔn)曲線R2在0.995以上，cv在10%以內(nèi)，見(jiàn)表1；加標(biāo)樣品檢測(cè)值分別為34.4、74、115.6和132.6 mg/100 g，計(jì)算加標(biāo)回收率分別為87.21%、108.11%、115.6%和105.58%，見(jiàn)表2加標(biāo)回收率在87.21%-115.6%之間。此結(jié)果表明添加不同濃度的乳鐵蛋白，均有較好的回收率，試劑盒準(zhǔn)確性符合要求。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果

表2 加標(biāo)回收結(jié)果

2.2 試劑盒可行性性驗(yàn)證

8種不同的奶粉樣檢測(cè)結(jié)果顯示：標(biāo)準(zhǔn)曲線R2在0.995以上，cv在10%以內(nèi)，見(jiàn)表3；樣品檢測(cè)值除奶粉樣1和奶粉樣3外，見(jiàn)表4，其余均符合樣品理論值（樣品理論值范圍為：40-86 mg/100 g）。后又對(duì)奶粉樣1和奶粉樣3進(jìn)行復(fù)檢，結(jié)果顯示：標(biāo)準(zhǔn)曲線R2在0.995以上，cv在10%以內(nèi)，見(jiàn)表5；奶粉樣1和奶粉樣3分別稱取的平行樣檢測(cè)值分別為42、45.6、59.8和46.2 mg/100 g，見(jiàn)表6，符合樣品理論值。分析這種異常值的出現(xiàn)可能是由于奶粉前處理方法不當(dāng)，或者奶粉中的乳鐵蛋白混合不均勻，造成結(jié)果與理論值有較大偏差。

表3 標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果

2.3 樣品前處理優(yōu)化后檢測(cè)結(jié)果

使用優(yōu)化后的前處理方案連續(xù)2天對(duì)16種樣本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示：標(biāo)準(zhǔn)曲線R2在0.995以上，cv在10%以內(nèi)，見(jiàn)表7和表9；樣品檢測(cè)值全部符合品理論值，見(jiàn)表8和表10，未出現(xiàn)異常值現(xiàn)象。優(yōu)化后的前處理方案，連續(xù)跟蹤2天，18種奶粉樣，均為出現(xiàn)異常值，說(shuō)明此優(yōu)化方案可行。

表4 奶粉樣本檢測(cè)結(jié)果

表5 標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果

表6 奶粉樣本檢測(cè)結(jié)果

表7 標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果

表8 奶粉樣本檢測(cè)結(jié)果

2.4 不同采樣點(diǎn)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

對(duì)奶粉樣本27、28、29、和30分別采取3種不同的采樣點(diǎn)采取樣本，使用優(yōu)化后前處理方案處理樣本，檢測(cè)結(jié)果如下：標(biāo)準(zhǔn)曲線R2在0.995以上，cv在10%以內(nèi)，見(jiàn)表11；奶粉27和29檢測(cè)結(jié)果符合品理論值，而奶粉樣本28和30不同采樣點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果偏差較大，見(jiàn)表12，其中奶粉樣本28-1和30-3與樣品理論值偏差較大，相對(duì)偏差達(dá)173%和171%。分析可能由于乳鐵蛋白是干法混合，會(huì)造成混合不均勻，所以造成不同采樣點(diǎn)，出現(xiàn)異常值。

表9 標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果

表10 樣本檢測(cè)結(jié)果

表11 標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果

表12 奶粉樣本檢測(cè)結(jié)果

2.5 改良工藝后檢測(cè)奶粉樣本中乳鐵蛋白的均勻度

由于干混法會(huì)造成乳鐵蛋白在奶粉樣本中混合不均勻，所以在干混法基礎(chǔ)上進(jìn)行工藝改良。后又對(duì)對(duì)奶粉樣本31、32、33、和34分別采取3種不同的采樣點(diǎn)采取樣本，使用優(yōu)化后前處理方案處理樣本，檢測(cè)結(jié)果如下：標(biāo)準(zhǔn)曲線R2在0.995以上，cv在10%以內(nèi)，見(jiàn)表12；4種奶粉樣本檢測(cè)結(jié)果均符合品理論值，見(jiàn)表13。

表12 標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果

表13 奶粉樣本檢測(cè)結(jié)果

3 討 論

乳鐵蛋白是奶粉中最重要的營(yíng)養(yǎng)素之一[7]，選擇一種快速簡(jiǎn)便準(zhǔn)確的檢測(cè)方法對(duì)乳品廠十分重要。酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)是測(cè)定乳鐵蛋白含量最常用的方法之一，張英華等[8]首次在國(guó)內(nèi)發(fā)表，應(yīng)用酶聯(lián)免疫法測(cè)定牛初乳中乳鐵蛋白的含量；劉青等[9]使用ELISA法對(duì)市售的多個(gè)品牌的進(jìn)口嬰幼兒配方奶粉中的乳鐵蛋白蛋白進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)此法有較好的適用性。本文中，選擇ELISA法檢測(cè)奶粉樣本，發(fā)現(xiàn)采用未優(yōu)化的前處理方案，檢測(cè)結(jié)果會(huì)出現(xiàn)異常值，分析可能是由于前處理方法不當(dāng)，造成稀釋后的乳鐵蛋白在樣本中分布不均勻，或者是由于干法混合乳鐵蛋白造成乳鐵蛋白在樣本中不均勻；通過(guò)優(yōu)化前處理方法，連續(xù)跟蹤兩天實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)18個(gè)樣本，均未出現(xiàn)異常值，這說(shuō)明優(yōu)化后的前處理方法對(duì)ELISA試劑盒有較好的適用性；3點(diǎn)采樣法檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)異常值，這就更加說(shuō)明了使用干法混合會(huì)造成不同點(diǎn)的乳鐵蛋白含量可能不同，董昊昱等[10]報(bào)道干法混合會(huì)對(duì)微量營(yíng)養(yǎng)素混合的均勻性有一定的影響。對(duì)工藝進(jìn)行改良后，分3點(diǎn)進(jìn)行采樣檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果均符合理論添加值，說(shuō)明改良后的工藝，乳鐵蛋白混合均勻，符合產(chǎn)品設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)。

4 結(jié)論

本研究使用ELISA快速檢測(cè)試劑盒檢測(cè)奶粉樣本中的乳鐵蛋白含量，線性關(guān)系良好，試劑盒加標(biāo)回收率為87.21%-115.6%之間，符合檢測(cè)要求；通過(guò)優(yōu)化前處理方案，保證了檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性；在干混法基礎(chǔ)上，通過(guò)工藝改良，乳鐵蛋白能在奶粉樣本中均勻存在。