二維液相色譜同時測定嬰幼兒配方乳粉中多種脂溶性維生素

趙玉富，劉曉玲，咸偉玥，王劍飛，單藝

（1.黑龍江省質量技術監督檢測研究院，哈爾濱1500501；2.東北農業大學黑龍江省綠色食品科學研究院，哈爾濱150028）

0 引 言

嬰幼兒配方乳粉是指以乳類及乳蛋白制品和/或大豆及大豆蛋白制品為主要原料，加入適量的維生素、礦物質和/或其他輔料，僅用物理方法生產加工制成的粉狀產品[1-2]嬰幼兒配方乳粉的營養成分及含量一般都參照母乳進行合理的配方加工生產。近年來嬰幼兒配方乳粉的營養成分和產品質量備受關注，2016年3月15日經國家食品藥品監督管理總局局務會議審議通過《嬰幼兒配方乳粉產品配方注冊管理辦法》，2016年6月6日發布，10月1日實施。2019年2月1日，市場監督管理總局發布《市場監督管理總局關于印發2019年食品安全監督抽檢計劃的通知》明確每月對全部已獲配方注冊且在售的國產和進口嬰幼兒配方乳粉生產企業的產品進行抽檢，所以嬰幼兒配方乳粉中維生素的檢測一直是生產企業和質檢部門的重點工作。國家標準檢驗方法中對于維生素A、維生素E采用GB 5009.82-2016第一法，維生素D2、維生素D3采用GB 5009.82-2016第四法，β-胡蘿卜素的檢驗采用采用GB 5009.83-2016，實際檢驗效率很低[3-4]。

嬰幼兒配方乳粉中維生素A、維生素E、維生素D2、維生素D3及β-胡蘿卜素均為脂溶性維生素，檢驗提取過程相同，但是其中維生素A、維生素E、β-胡蘿卜素為反相高效液相色譜法檢測，維生素D2、維生素D 3為正相高效液相色譜半制備后由反相高效液相色譜檢測，操作過程繁瑣。由于嬰幼兒配方乳粉中存在從納克到毫克級不同含量水平的維生素，各維生素化學性質的差異使得所有維生素的共同提取和分析極具挑戰，此前安捷倫應用解決方案和文獻有同時檢測多種脂溶性維生素的方法[5-13]。但針對嬰幼兒配方乳粉的前處理過程不能滿足國標要求。

近年二維液相色譜法發展迅速，由于其能實現在一維色譜柱分離復雜基質的微量目標物并直接切換到二維色譜柱進行精確測定，實現了樣品的在線凈化，提高了分析靈敏度，成為了復雜基質樣品檢測的發展趨勢。本文采用雙泵雙檢測器系統以六通閥切換一維色譜柱的分離物經捕獲柱進入二維色譜柱檢測實現同時測定嬰幼兒配方食品中的五種脂溶性維生素。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

二維液相色譜系統及其色譜工作站（1260 Infinity-2D，Agilent Technologies美國，配備雙二極管陣列檢測器），電子分析天平（BSA 2202S 0.01 g、BT 25S 0.01 mg賽多利斯），恒溫攪拌水浴鍋（HL-9、上海浦東物理光學儀器），旋轉蒸發儀（RE-52AA、上海亞榮生化儀器）維生素A標準物質（純度95.0%，Dr Ehrenstorfe），β-胡蘿卜素標準物質（純度93.0%，Dr Ehrenstorfe），維生素D2標準物質（純度98.0%，Dr Ehrenstorfe），維生素D3標準物質（純度99.9%，Dr Ehrenstorfe），維生素E標準物質（dl-α-生育酚，純度98.0%，Dr Ehrenstorfe），甲醇（色譜純，Fisher Chemical），乙腈（色譜純，Fisher Chemical），石油醚（沸程30～60分析純，科密歐），無水乙醇（分析純，科密歐），氫氧化鉀（分析純，西隴科技），抗壞血酸（分析純，西隴科技），2，6-二叔丁基対甲酚（分析純，西格瑪），試驗用水為超純水。嬰幼兒配方乳粉（市售）。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件的選擇

C18色譜柱為國標檢驗分析脂溶性維生素選擇，考慮到檢驗的分離效果和時間成本本實驗選擇Agilent Technologies InfinityLab Poroshell 120 EC-C8作為一維分離柱，C8相對于C18有著更快的分離時間，而Poroshell 120系列色譜柱采用安捷倫公司專利的制造工藝，在實心核外包上表面多空層，能顯著提高被分析物在固定相和流動相之間的傳質，使其在較低反壓下實現快速高效的分離。二維色譜柱選擇Agilent Technologies Zorbax Eclipse PAH考慮到分離維生素D2和維生素D3的分離度，在相同流動相條件下PAH色譜柱可通過降低柱溫實現維生素D2和維生素D3的基線分離。

維生素A、維生素E、維生素D2、維生素D3均能溶解于甲醇、乙腈中，而β-胡蘿卜素不溶于甲醇、乙腈，易溶于三氯甲烷、四氫呋喃。實驗選擇乙腈/甲醇/四氫呋喃（75∶25∶5，體積比）溶解樣品提取物能同時溶解5種被測維生素。同時對于一維色譜柱的分離需要進行梯度洗脫，三氯甲烷與水不混溶，因此在同時分離維生素A、維生素E、維生素D2、維生素D3及β-胡蘿卜素時選擇乙腈/甲醇/四氫呋喃作為流動相。對于一維色譜柱必須以梯度洗脫使維生素A的出峰時間延后使其與干擾物質分離，對于二維色譜柱比較流動相對維生素D2和維生素D3分離效果的影響，實驗發現使用純甲醇作為二維流動相時目標物響應值最高，以甲醇為流動相會造成目標物出峰過快，因此二維色譜柱選用柱長250 mm的色譜柱。

維生素A、維生素E和β-胡蘿卜素在嬰幼兒配方乳粉中含量較高，維生素D2和維生素D3含量較低，且樣品基質干擾較大，原標準方法需經過正相制備色譜的凈化，將含有維生素D2和維生素D3的餾分蒸干定容后，再在反相色譜上進行分析。本研究采用二維色譜分離的中心切割法，樣品在一維色譜柱實現初步分離后，將含有維生素D2和維生素D3的餾分切割至二維色譜柱中進行分離。系統連接圖（見圖1）。為確定閥的準確切換時間，實驗將關閉閥切換命令使一維色譜柱直接與一維檢測器連接，進標準品溶液，測定維生素D2和維生素D3的出峰時間起點和終點。由于使用捕獲柱收集一維色譜柱的維生素D2和維生素D3的餾分，而捕獲柱柱容量小，需要考慮在閥切換的時間段內捕獲柱是否能完全將維生素D2和維生素D3收集到。由圖1可知影響維生素D2和維生素D3是否被完全收集的因素主要有兩點，一是一維色譜柱對維生素D3的分離效果，二是一維泵系統的流速設計，實驗中我們內徑3.0 mm、填料粒徑2.7μm的一維色譜柱，流速為0.6 mL/min，由標準品測試確定出閥切換時間為7.80 min更改閥的位置端口1-＞6，8.90 min更改閥的位置端口1-＞2。

一維條件：Agilent Technologies InfinityLab Poroshell 120 EC-C8（3.0 mm×150 mm，2.7μm），流速為0.6 mL/min梯度洗脫，洗脫程序見表1。一維DAD檢測器采用波長切換方式檢測（VA∶326 nm；VE∶285 nm；β-胡蘿卜素450 nm）。二維條件：Agilent Technologies Zorbax Eclipse PAH（4.6 mm×250 mm，5μm），流速為0.3 mL/min，流動相為甲醇。二維DAD檢測器檢測（VD2VD ∶3264 nm），柱溫均為25℃，進樣量為10μL，閥切換時間為7.80 min更改閥的位置端口1-＞6，8.90 min更改閥的位置端口1-＞2。捕獲柱為SB-C18（4.6 mm×12.5 mm，5μm）。

圖1 二維液相閥切換流路示意圖

表1 一維液相梯度洗脫程序

1.2.2 標準溶液配制

分別稱取一定量的維生素A、維生素E、維生素D3標準品于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，混勻。經校正維生素A貯備液濃度為500μg/mL；維生素E標準貯備液濃度為1 000μg/mL；維生素D2貯備液濃度為100μg/mL；維生素D3貯備液濃度為100μg/mL；稱取一定量的β-胡蘿卜素標準品于100 mL棕色容量瓶中，用二氯甲烷溶解并稀釋至刻度，混勻，經校正β-胡蘿卜素貯備液濃度為500μg/mL；分別移取上述標準溶液工作液適量，以流動相B乙腈/甲醇/四氫呋喃（75∶25∶5，體積比）稀釋成混合工作液，維生素A工作液濃度為20.0μg/mL；維生素E標準工作液濃度為200μg/mL；維生素D2工作液濃度為1.00μg/mL；維生素D3工作液濃度為1.00μg/mL；β-胡蘿卜素工作液濃度為10.0μg/mL。將維生素A、E、D2、D3、β-胡蘿卜素混合標準工作液稀釋成標準曲線工作液。

1.2.3 樣品測定

根據相關國家標準稱取嬰幼兒配方乳粉樣品5.00 g（精確至0.01 g）于250 mL錐形瓶中，加入1 g抗壞血酸，50 mL溫度50℃的水充分溶解樣品，加入0.5 g木瓜蛋白酶，蓋上瓶塞于55℃的水浴中磁力攪拌30 min。向預處理后的試樣中加入80 mL無水乙醇和30 mL氫氧化鉀溶液，蓋上瓶塞于55℃的水浴中磁力攪拌回流皂化30 min。將皂化液移至500 mL分液漏斗中，以石油醚萃取兩次次，每次100 mL，合并萃取液，萃取液以水洗滌至中性，收集石油醚層，經過無水硫酸鈉脫水后轉移至旋蒸瓶中。40℃旋蒸至近干，取下氮氣吹干，再以流動相B乙腈/甲醇/四氫呋喃（75∶25∶5，體積比）溶解并轉移定容至10 mL作為待測液。

2 結果

2.1 方法線性范圍與精密度

按照2.2.2標準曲線配制維生素A、E、D2、D3、β-胡蘿卜素標準曲線，并對維生素A、E、D2、D3、β-胡蘿卜素加標樣品重復進樣六次，以峰面積計算方法精密度，方法精密度良好，標準曲線范圍、線性方程及精密度見表2。

表2 標準溶液線性關系與精密度

2.2 樣品分析結果

按照2.2.3樣品測定方法對嬰幼兒配方乳粉樣品進行分析，標樣譜圖見圖2，樣品分析譜圖見圖3，采用波長切換模式在一維檢測器中同時測定的維生素A、維生素E及β-胡蘿卜素出峰位置無干擾峰，二維檢測器中的維生素D2和維生素D3與干擾峰分離度很高，不會對結果造成影響。

圖2 維生素A、維生素E、維生素D 2、維生素D3及β-胡蘿卜素標樣譜圖

圖3 樣品中維生素A、維生素E、維生素D2、維生素D 3及β-胡蘿卜素譜圖

表3 樣品測試結果與加標實驗結果

2.3 國標法與本研究的比較

對市售嬰幼兒配方乳粉中維生素質控樣品進行測試并同時對實驗樣品的五種維生素做加標實驗數據見表3，實驗樣品中不含維生素D2，其余4種維生素實測值偏差5種維生素加標回收率在90%～98%之間。結果表明該方法準確度較高。

3 結 論

本方法實現維生素A、維生素E、β-胡蘿卜素及維生素D2、維生素D3同時檢測，并且維生素D2與維生素D3分離度高，相對于正相高效液相色譜半制備檢測分析時間縮短為25 min，免去了正相制備過程的大量試劑消耗。方法線性范圍為：維生素A為0.0945μg/mL～14.17μg/mL，維生素E為1.21μg/mL～181.5μg/mL，β-胡蘿卜素為0.0163μg/mL～2.445μg/mL，維生素D2為 0.0163μg/mL～2.445μg/mL，維生素 D3為0.0150μg/mL～2.500μg/mL，相關系數 r均大于0.999。本方法實現了5種維生素同時檢測，重現性好，準確度高，為嬰幼兒配方乳粉中維生素含量測定提供了參考。