高致病性H7N9禽流感病毒研究進展

董曉春

H7N9禽流感自2013年在中國華東地區被發現以來，已經在人群中出現了5次疫情：其中從疫情開始到第5次疫情結束，全球共報告人感染H7N9禽流感實驗室確診病例1 567 例［1］。其中從2016 年10月—2017年9月的第5次疫情報告的感染人數和死亡人數均遠超過前4 波疫情，引起了國內外學者的廣泛關注［2］。特別是從第5 次疫情的患者中分離到了高致病性的H7N9禽流感病毒（HPAI H7N9），鑒于既往人感染H7N9 禽流感后的嚴重程度，HPAI H7N9禽流感病毒的出現可能會造成更大的危害［3］。近期多國的學者也對HPAI H7N9 禽流感的流行病學、分子生物學等方面進行了廣泛的研究。本文綜合相關研究對HPAI H7N9 禽流感病毒各方面生物學研究進展做一綜述。

1 H7N9禽流感病毒的進化

1.1 基本特征 在中國首次發現的新的H7N9禽流感病毒屬于正黏病毒科甲型流感病毒屬。甲型流感病毒根據其表面糖蛋白血凝素（haemagglutinin，HA）和神經氨酸酶（neuraminidase，NA）抗原性的不同可分為多個亞型，H7N9屬于其中一個亞型。根據基因測序結果，2013年新出現的H7N9禽流感病毒HA基因與浙江鴨群的H7N3 亞型（A/duck/Zhejiang/12/2011）高度同源，NA 基因與韓國水鳥中的H7N9（A/wild bird/Korea/ A14/2011）同源，內部的6 個基因（PB2、PB1、PA、NP、M、NS）分別來自中國東南部（上海、浙江）的家禽以及北京地區的禽鳥的兩種H9N2亞型［4］。

由于人類上呼吸道組織和氣管主要含有唾液酸α-2，6 型受體，α-2，3 型受體多見于禽類呼吸道表面。而禽流感病毒通常與禽類的唾液酸α-2，3受體結合。2013 年新發現的H7N9 禽流感病毒的HA 基因在G186V、Q226L 和T160A 等位點發生氨基酸替換，這些突變使其可以同時結合人類的唾液酸α-2，6受體和禽類的α-2，3受體，從而獲得了感染人類的能力［5-6］。禽流感病毒是根據其對禽類致病性的強弱可分為高致病性和低致病性，由于2013年出現的H7N9 禽流感病毒對禽類來說致病比較溫和，且在HA蛋白的裂解位點周圍只存在單個堿性氨基酸，未觀察到與高致病性禽流感相似的氨基酸序列，因此被認定為低致病性的禽流感病毒［7］。

1.2 病毒進化與高致病性演變 中國低致病性H7N9 禽流感病毒分離株的核酸序列分析表明病毒可分為長三角分支及珠三角分支兩種體系株，長江三角洲地區被認為是2013年開始出現的H7N9禽流感疫情的源頭［8］。同年8 月廣東分離的1 株病毒株（A/Guangdong/1/2013）與之前測序的長三角H7N9病毒株相比，其NS和NP基因與當地流行的H9N2亞型禽流感病毒更為接近，被稱為珠三角分支。后者系從前者進化而來，兩者在傳播力和致病性上無明顯區別［9］。第2、3次疫情（2013年10月—2015年9月）以長三角和珠三角為源頭向其他地區輻射，從華東逐漸向華南地區轉移，在此過程中產生了重組H7N9病毒，新的H7N9 變異體含有內部基因片段PB1、PB2、NP和NS與當地禽類循環H9N2菌株密切相關。而新的變異也引起了H7N9 禽流感病毒在抗原性、耐藥性方面出現一些變化［10］。與前3次疫情中分離的病毒相比，第4 次疫情中分離到的H7N9 毒株在HA 和NA 基因中的突變較少，在病毒聚合酶基因中鑒定出哺乳動物適應的遺傳標記的頻率與前3次疫情保持一致［11］。

從第5 次疫情開始到2016 年12 月分離的病毒株的基因特征與前4 次疫情中分離的病毒相似，屬于低致病性禽流感病毒（LPAI H7N9），直到2017 年廣東省疾病預防控制中心對分離到的毒株A/Guangdong/Th008/2017 和A/Guangdong/Th005/2017進行了基因測序分析，發現在該2株病毒的HA鏈接肽位置發生了基因插入性突變，HA蛋白水解切割位點HA1 和HA2 連接區域獲得4 個氨基酸（KRTA）的插入突變，此類基因引起病毒對家禽毒力的增強，提示經過4 年的進化和突變，中國已出現HPAI H7N9禽流感病毒［12］。Xiang 等［13］從第5 次疫情中共發現有69 個HA 基因插入4 種類型的HPAI 序列，分別是-PKGKRIAR/GLF-、-PKGKRTAR/GLF-、-PKRKRAAR/GLF-、-PKRKRTAR/GLF-。這些HPAI H7N9病毒的HA序列在核苷酸水平上比LPAI具有較高的遺傳同源性。同時，HPAI和LPAI H7N9病毒的NA 和6 個內部基因在核苷酸水平上表現出相似性。

2 高致病性H7N9禽流感病毒

2.1 HPAI H7N9 病例流行病學特征 截至2018 年8 月，全球共報告32 例人感染HPAI H7N9 病例，這32例病例來自我國臺灣地區（該病例曾前往廣東）、廣西、廣東、湖南、陜西、河北、河南、福建、云南省，其中廣西壯族自治區報告的病例最多，其次為廣東省。所有病例發病日期均在2017 年10 月之前［14］。Zhou等［15］對廣西、湖南、廣東的8例HPAI H7N9病例臨床特征分析發現，8例患者中位年齡57歲（28～71歲），男4例（50%）；大多數（75%）病例患者生活在農村地區，并且在發病10 d 內全部接觸家禽。8 例患者發病到入院時間為2.5 d（0～5 d），均接受奧司他韋治療，發病到用藥為4 d（1～8 d）。4例患者發病后平均6.5 d（5～44 d）死亡，4 例痊愈，平均住院29 d（21～52 d）。與LPAI 病例特征比較發現，HPAI 患者更多生活在農村地區（88%vs.47%），發病前曾接觸病禽或死禽（50%vs.16%），發病到住院時間較短（2.5 dvs.5 d）。在年齡、性別、基礎慢性病患病率、發病至抗病毒治療的中位時間、接受奧司他韋治療、重癥監護病房入院或機械通氣的患者比例方面無顯著性差異。盡管HPAI 患者從發病到死亡的中位時間較LPAI 患者短（6.5 dvs.13 d），總體病例死亡率高于LPAI患者（50%vs.37%），但差異無統計學意義。廣東省對本省的9 例HPAI H7N9 病例與LPAI 病例特征做了比較，兩者在性別、年齡、臨床表現方面并無差異，兩者活禽市場接觸史的比例也基本相似。但HPAI 病例接觸活禽或死禽的比例均高于LPAI 病例，HPAI 病例在后院飼養家禽比例明顯高于LPAI病例（77.8%vs.29.4%）。同時HPAI 患者從入院到出院的時間較LPAI患者顯著延長。在死亡患者中，更多的HPAI 患者從住院到死亡的持續時間大于21 d（HPAI：3/5；LPAI：2/22）［16］。

2.2 變異來源 為追溯HPAI H7N9共同的起源，中國的學者對25株人感染的HPAI H7N9與14株禽源HPAI H7N9 病毒做了全基因測序；結果發現所有的HPAI H7N9 病毒都可以歸類為單個基因簇，被稱為HPAI H7N9 簇。而HPAI H7N9 簇完全歸類為長江三角洲譜系。通過共祖時間（TMRCA）分析發現，HPAI H7N9 的H7 基因來源時間估計為2016 年5 月下旬。所有的禽和人的HPAI H7N9 病毒分離株均來源于廣東省分離的LPAI H7N9病毒。廣東省可能是LPAI H7N9 病毒獲得4 個氨基酸插入并突變為HPAI H7N9病毒的關鍵地區。HPAI H7N9譜系中觀察到的幾個亞群，包括來自廣西、湖南、陜西和內蒙古等地區的HPAI H7N9病毒均被歸類為廣東亞群，表明該亞群的HPAI H7N9病毒可能來源于廣東省，隨后傳播到其他地區［17］。Su 等［18］對全球共享禽流感數據倡議組織（GISAID）的數據庫和核酸序列數據庫（Genbank）中第5 次疫情中出現的HAPI H7N9病毒序列分析，同樣發現所有的HPAI H7N9序列均來自珠江三角洲地區，表明這個地區最有可能是這種病毒的來源。我國臺灣地區分離的A/Taiwan/1/2017（H7N9）的HA 和NA 基因與大陸地區分離的病毒同屬于長三角分支。它的6個內部基因中，PB1和M 基因與A/Anhui/1/2013 疫苗株及2016、2017 年新近從江蘇省、浙江省、福建省和廣東省分離的病毒位于同一個分支，聚類分析則顯示其PB2、PA 和NS 基因與早期的H7N9 亞型歸為一類，與2016—2017 年新近的病毒無關［19］。

2.3 突變情況 對廣東HPAI H7N9 分離株A/Guangdong/17SF003/2016 和A/Guangdong/17SF006/2017 測序發現，HA 蛋白的226L 變回為226Q，這一突變與LPAI H7N9的Q226L突變相反。既往研究證明Q226L突變可提高病毒對哺乳動物唾液酸受體的結合能力［20］。2 株HPAI H7N9 病毒與典型的LPAI H7N9病毒相比，除具有雙重受體α-2，6和α-2，3結合特性以外與α-2，3 受體的親和力明顯增加。與LPAI H7N9 病毒不同，HPAI H7N9 病毒在胰蛋白酶存在或不存在時具有相似的復制能力，表明其胰蛋白酶獨立特性［21］。從臺灣毒株的分析結果看，HA中未發現Q226L/I 和G228S 這2 個與人類受體高親和力結合的突變，但有S138A、T160A 和G186V 共3 個突變，與病毒與人類受體的結合能力有關；PB2蛋白中有E627K 的替換，與病毒的復制能力增加有關；PB1-F2 蛋白有90 個氨基酸，NS1 蛋白中存在P42S和D92E的替換，都可能使H7N9對實驗動物的毒力增強［19］。另外，Yang 等［17］同時對28 株人感染HPAI H7N9分離株與21株禽源HPAI H7N9分離株做基因測序，結果顯示所有21 株禽源毒株和25/28 株人源毒株分別發生G186V 和L226Q 的替換，L226Q 替換雖減弱了病毒與哺乳動物唾液受體的結合能力，但研究發現HA蛋白中G186V單獨存在也可增加病毒與受體的親和力［6］。在28 株人源毒株的PB2 蛋白中，分別出現T271A、Q591K替換各1株，E627K替換14株，D701N替換4株，這些置換與小鼠聚合酶活性增加或毒力增強有關。但在禽源HPAI H7N9 中未檢測到這樣的突變。而此類突變通常在禽流感病毒傳播到哺乳動物宿主時常被觀察到［22-23］。

2.4 抗原性分析 為了研究HPAI 和LPAI H7N9病毒之間的抗原性差異，Zhu 等［21］使用雪貂抗血清對A/anhui/1/2013（野生型）、A/anhui/1/2013（反向遺傳株）和A/shanghai/2/2013（野生型）進行雪貂抗血清測定。抗原分析表明，除A/hunan／06948／2017 和A/anhui/60933/2016之外，所有的LPAI H7N9病毒與H7N9疫苗株A/anhui/1/2013（野生型或反向遺傳株）或A/shanghai/2/2013 的雪貂抗血清反應良好。然而，HPAI H7N9（A/Guangdong/17SF003/2016 和A/Guangdong/17SF006/2017）對LPAI H7N9疫苗株的抗血清表現出低或無反應性。

2.5 對動物的致病力 聯合國糧食及農業組織統計，截至2018年9月5日，全球共從動物或外環境中檢出58 株HPAI H7N9，其中46 株來自雞、2 株來自鴨、10株來自環境標本［24］。HPAI H7N9的致病性方面，中、美、日三國聯合研究發現，以HPAI H7N9 毒株A/Guangdong/17SF003/2016（GD/3）為研究材料，分析其在不同小鼠、雪貂和食蟹猴等動物模型上的致病力和傳播力，以GD/3 為骨架，構建了2 株攜帶NA R294K 耐藥性突變的重組病毒，分別命名為rGD/3-NA294R 和GD/3-NA294K，以及LPAI H7N9（A/anhui/1/2013），與其他兩株病毒相比，HPAI H7N9（GD/3）和藥物敏感毒株（rGD/3-NA294R）對小鼠和雪貂的致病力更強，4 株病毒在雪貂動物模型上通過空氣飛沫傳播的能力差異無統計學意義，提示HPAI H7N9 病毒相對于LPAI H7N9 病毒來說，傳播力沒有改變。耐藥毒株（rGD/3-NA294K）在細胞和動物組織的復制能力要低于對應的敏感病毒［25］。Shi 等［26］發現分離得到的HPAI H7N9 在48 h 內使雞100%死亡，靜脈致死系數為3，從生物學上證明對雞具有高致病性；HPAI H7N9感染小鼠或雪貂后，致病性同LAPI H7N9 病毒類似，但臨床癥狀較輕；HPAI H7N9 病毒感染雪貂后，在雪貂體內復制一代后可獲得適應哺乳動物關鍵突變，PB2基因627 位突變為K或701位突變為N，突變后的毒株對小鼠的致病力增加萬倍以上，可引起雪貂嚴重發病、死亡。HA和PB2基因的聯合突變增強了對哺乳動物的致病性［26］。

2.6 耐藥與治療藥物 既往對LPAI 的研究發現，NA 的神經氨酸酶抑制劑的耐藥位點突變包括：E119V、R292K、R152K 和A246T。這4 個耐藥突變均在人感染LPAI H7N9 中檢測到［8，27］。對禽類研究發現，當野鴨暴露于低濃度的奧司他韋時，發生了I222T位點的突變，從而獲得一定的耐藥性［28］。對于HPAI H7N9，廣東省對2 株HPAI H7N9（A /Guangdong/Th008/2017和A/Guangdong/Th005/2017）測序發現，A/Guangdong/Th008/2017 的PB2 未發現突變，但發現經奧司他韋治療后NA 中出現耐藥性突變R292K。據報道，在NA 蛋白中具有R292K 突變的H7N9病毒對多種基于神經氨酸酶抑制劑的藥物具有耐藥性［29］。A/Guangdong/Th005/2017PB2 有2個突變K526R和E627K，但未發現NA 具有對奧司他韋的抗性［12］。綜合禽源和人源HPAI H7N9 對比發現［17］，禽源高致病性毒株NA 蛋白未發生R292K突變，提示禽源毒株尚未產生對NA抑制劑類藥物的耐藥性；而同期人源部分毒株發生了R292K 突變。在2 株人源病毒分離物中發現NA 蛋白突變E119V和H274Y，既往報道這2 個突變也與病毒的耐藥性有關［30-31］。在禽源病毒中同樣沒有檢測到以上的替換。所有取樣的HPAI H7N9毒株，不論人或禽源所有分離株的M2 蛋白均發生了S31N 變異，表明毒株對金剛乙胺的敏感性降低。

鑒于HPAI H7N9 對傳統的抗流感藥物出現不同程度的耐藥，一些新型的藥物也被運用于H7N9的治療。香港的研究者發現一種新藥，名為DAS181（FludaseTM）。與奧司他韋等神經氨酸酶抑制劑類藥物不同，DAS181 的主要成分是唾液酸酶融合蛋白，其作用的對象是細胞本身，使宿主細胞表面的唾液酸受體失去活性，流感病毒就無法與受體結合，也就無法附著細胞。由于DAS181不直接作用于病毒，不容易出現病毒耐藥性問題。DAS181在鼠、MDCK細胞、分化的人類上呼吸道組織以及支氣管組織上的試驗取得了良好的療效［32］。利巴韋林作為具有良好特性的廣譜核苷酸抑制劑，可以通過RNA聚合酶停止病毒RNA 和mRNA 的合成和加帽。無論通過體內還是體外試驗證實利巴韋林對神經氨酸酶抑制劑有抗藥性的H7N9病毒感染有良好的效果［33］。美國的一項研究發現一種新型的天然Ⅰ型干擾素，稱之為“Alferon N”，該藥物曾被用作嚴重急性呼吸綜合征（SARS）的治療，該研究通過體內試驗發現，對于神經氨酸酶抑制劑耐藥株與不耐藥株，Alferon N均能有效抑制H7N9病毒的復制［34］。另外一種藥物被稱為VIS410，是一種靶向甲型流感病毒株的單克隆抗體，該藥物可以通過結合血細胞凝集素來防止流感病毒與宿主細胞融合，從而終止病毒的復制，達到清除病毒治療流感的目的。試驗發現，該藥物能有效降低試驗小鼠的病死率以及肺內的H7N9病毒載量［35］。

2.7 疫苗 針對2013 年新出現的H7N9 禽流感病毒，世界衛生組織（WHO）采用首次分離得到的2 株H7N9 禽流感毒株A/Anhui/1/2013 和A/Shanghai/2/2013作為疫苗候選株的母株［36］，目前已有禽用疫苗已在中國大陸地區開展免疫接種，如重組禽流感病毒（H5+H7）二價滅活疫苗（H5N1 Re-8 株H7N9-Re1 株）已在南方地區推廣，并取得了良好的效果［37］。另外多種人用疫苗已在臨床試驗階段，其中分為幾個類型，如經反向遺傳技術改造的禽流感病毒滅活疫苗，包括雞胚生產和細胞生產的滅活疫苗［38-39］，基因工程活載體疫苗包括新城疫、桿狀病毒等為載體表達的重組疫苗，基于禽流感病毒HA 蛋白的DNA 疫苗等［40-42］。鑒于第5 次疫情中的H7N9高致病性突變株，且對LPAI H7N9 疫苗株抗原性出現改變，WHO 在2017 增加HPAI 毒株A/Guangdong/17SF003/2016 為候選母株［43］，中國流感中心的研究人員利用反向遺傳技術（reverse genetics RG），以A/Puerto Rico/8/34 內部基因為骨架，以A/Guangdong/17SF003/2016為模板，構建了HPAI H7N9疫苗候選株RG-SF003，為下一步HPAI H7N9 疫苗的生產提供基礎［44］。

3 小結

第5次疫情中出現的HPAI H7N9禽流感病毒在基本流行病學特征雖未出現明顯變化，但農村病例、職業人群病例增多，同時病毒對動物的致病性增強。在抗原性和耐藥性方面發生了一定變化。因此，通過對家禽、環境和人群的持續監測，進一步研究HPAI H7N9 禽流感病毒的流行病學特征，加快新型抗病毒藥物和疫苗的研發等，對HPAI H7N9疫情的預防和控制具有重要意義。