明日葉葉斑病病原菌的生物學(xué)特性及室內(nèi)藥效試驗(yàn)

周潔 郭鳳領(lǐng) 符家平 肖穎 徐繩武 吳金平

摘 要：為了明確明日葉（Angelica keiskei）葉斑病病原菌鏈格孢（Alternaria alternata）的生物學(xué)特性而進(jìn)行了室內(nèi)藥劑篩選，為該病的防治提供理論依據(jù)。以蔬菜種質(zhì)創(chuàng)新與遺傳改良湖北重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存的明日葉葉斑病病原菌為材料，對(duì)病原菌的生物學(xué)特性進(jìn)行測(cè)定，并在室內(nèi)對(duì)11種藥劑進(jìn)行篩選。鏈格孢（Alternaria alternata）菌絲生長(zhǎng)致死溫度為55 ℃;適宜pH范圍為8～10;最佳氮源為酵母浸出物，最佳碳源為甘露醇;稀釋1 000倍的60%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑和稀釋2 000倍的32.5%苯甲嘧菌酯懸浮劑對(duì)該病原菌抑制率達(dá)50%以上。綜合以上結(jié)果，明日葉葉斑病病原菌適宜在弱堿性和富含有機(jī)營(yíng)養(yǎng)的環(huán)境下生長(zhǎng)，可選用苯醚甲環(huán)唑和苯甲嘧菌酯作為田間防治藥劑。

關(guān)鍵詞：明日葉;葉斑病;鏈格孢;生物學(xué)特性;藥劑篩選

Pathogen biological characteristics and fungicide-screening for leaf spot disease of Angelica keiskei

ZHOU Jie1， GUO Fengling1， FU Jiaping1， XIAO Ying1， XU Shengwu2， WU Jinping1

（1. Hubei Key Laboratory of Vegetable Germplasm Enhancement and Genetic Improvement / Institute of Economic Crops， Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan 430064， Hubei， China; 2. Xianning Academy of Agricultural Sciences， Xianning 437000， Hubei， China）

Abstract： The experiment was conducted to clarify the biological characteristics and fungicide-screening of Alternaria alternata， the pathogen of leaf spot disease of Angelica keiskei， to provide a theoretical basis for the controlling of the disease. The biological characteristics of A.alternata were determined， and 11 kinds of fungicides on pathogens was screened. The lethal temperature of mycelium growth was 55 ℃; the optimal pH range was 8 to 10; the best nitrogen source was yeast extract， the best carbon source was mannitol; 1 000 times solution of 60% difenoconazole water dispersible granules and 2 000 times solution of 32.5% azoxystrobin suspension showed best inhibition effect， and the mycelial growth inhibition rate exceeded 50%.The pathogen of leaf spot disease of A. keiskei is suitable for growth in a weak alkaline and organic-rich environment. Difenoconazole and azoxystrobin can be used as control agents in field.

Key words： Angelica keiskei; Leaf spot; Alternaria alternata; Biological characteristics; Fungicide-screening

明日葉（Angelica keiskei），又名明日草、八丈草、長(zhǎng)壽草等，是多年生草本植物，屬傘形科當(dāng)歸屬的藥食兩用蔬菜，有“21世紀(jì)健康食品”和“神奇植物”的美稱[1]。明日葉原產(chǎn)于日本八丈島，含有人體所需的多種維生素、氨基酸、礦物質(zhì)和微量元素等，同時(shí)還含有查爾酮、類黃酮及香豆素等天然活性成分，利于人體健康[2- 3]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，明日葉所含的膳食纖維也可為食品工業(yè)提供豐富的纖維功能成分來(lái)源[4]。隨著明日葉功能的不斷挖掘，明日葉被引進(jìn)中國(guó)，并被推廣規(guī)?；N植。未曾關(guān)注的病害問(wèn)題也日漸顯現(xiàn)，如由鏈格孢（Alternaria alternata）引起的葉斑病[5]，導(dǎo)致產(chǎn)量損失近40%，制約了明日葉產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。因此，明確該病病原菌的生物學(xué)特性及室內(nèi)藥劑的篩選，可為明日葉葉斑病的防治提供理論依據(jù)。目前關(guān)于明日葉的研究多在功能成分方面，有研究發(fā)現(xiàn)明日葉的抗血栓功能，對(duì)阿爾茨海默氏病引起的記憶缺陷的改善，明日葉提取物異煙肼酮的抑脂功能等[6-8]，對(duì)生產(chǎn)種植中病害的關(guān)注相對(duì)較少。研究表明，2017年湖北武漢地區(qū)發(fā)生明日葉葉斑病，經(jīng)鑒定其致病菌為鏈格孢（Alternaria alternata）[5]，而未見(jiàn)該致病菌生物學(xué)特性及室內(nèi)藥效等相關(guān)方面的報(bào)道，筆者以此為切入點(diǎn)開(kāi)展研究，對(duì)導(dǎo)致明日葉葉斑病的鏈格孢進(jìn)行生物學(xué)特性測(cè)定及室內(nèi)藥劑篩選，為進(jìn)一步防控該病害提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

明日葉葉斑病病原菌鏈格孢（Alternaria alternata）（MG661807）由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所蔬菜栽培實(shí)驗(yàn)室分離并保存，于2018年7月取出活化備用。11種化學(xué)藥劑于市場(chǎng)采購(gòu)，詳見(jiàn)表1。

1.2 方法

1.2.1 病原菌致死溫度的測(cè)定 試驗(yàn)方法參考郭強(qiáng)等[9]的方法。取保存的病原菌接種于PDA培養(yǎng)基平板上進(jìn)行活化，待菌落生長(zhǎng)3 d后，用打孔器于菌落邊緣處打取直徑為9 mm的菌塊放置于1.5 mL離心管中，在不同溫度梯度下水浴10 min后接種于PDA平板，24 h后觀察菌絲生長(zhǎng)情況。水浴溫度為30～65 ℃，每隔5 ℃為1個(gè)處理。每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.2.2 不同pH對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 用HCl和NaOH分別將PDA的pH調(diào)至4、5、6、7、8、9、10和11共8個(gè)梯度后倒平板，用打孔器于菌落邊緣處打取直徑為9 mm的菌塊接于不同pH的PDA平板中央，25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，測(cè)得數(shù)據(jù)平均值減去菌塊直徑9 mm，即為菌落生長(zhǎng)直徑。每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.2.3 氮源和碳源對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 以查氏（Czapek）培養(yǎng)基[10]為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以0.2 %的添加量分別添加甘氨酸、酵母、硫酸銨、硝酸鉀、蛋白胨、磷酸二氫銨、硝酸銨、L-谷氨酸鈉或硝酸鈉，配制不同氮源培養(yǎng)基，以無(wú)氮源培養(yǎng)基為對(duì)照;以3 %的添加量分別添加葡萄糖、D-果糖、α-乳糖、甘露醇、麥芽糖、可溶性淀粉或蔗糖，配制不同碳源培養(yǎng)基，以無(wú)碳源培養(yǎng)基為對(duì)照。用打孔器于菌落邊緣處打取直徑為9 mm的菌塊分別接于不同的培養(yǎng)基正中央，25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，測(cè)得數(shù)據(jù)平均值減去菌塊直徑9 mm，即為菌落生長(zhǎng)直徑。每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.2.4 殺菌劑對(duì)病原菌的生長(zhǎng)抑制作用的測(cè)定 利用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定供試藥劑對(duì)病原菌的抑制效果[11]。試驗(yàn)用的市售藥劑及使用濃度如表1所示。用無(wú)菌水配置藥劑母液，參照藥劑使用說(shuō)明以一定的比例加入50 ℃左右的PDA培養(yǎng)基中，使其達(dá)到推薦使用濃度，待充分混勻后倒入直徑為9 cm的玻璃培養(yǎng)皿中制成平板備用，以無(wú)菌水為對(duì)照。用打孔器于菌落邊緣處打取直徑為9 mm的菌塊分別接于不同的含藥培養(yǎng)基平板正中央，每個(gè)處理3次重復(fù)，25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，并計(jì)算抑菌率，計(jì)算方法如下：

抑菌率/%=[（對(duì)照菌落直徑-初始接種菌餅直徑）-（處理菌落直徑-初始接種菌餅直徑] ×100/（對(duì)照菌落直徑-初始接種菌餅直徑）。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用SPPS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，利用單因素方差分析比較差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌致死溫度的測(cè)定

將菌塊在不同溫度下水浴10 min后，觀察菌絲生長(zhǎng)，當(dāng)在溫度低于55 ℃時(shí)，24 h后均能長(zhǎng)出菌絲;當(dāng)溫度等于或高于55 ℃，24 h后菌絲不再生長(zhǎng)。由此可見(jiàn)，明日葉葉斑病病原菌的致死溫度為55 ℃。

2.2 不同pH對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

病原菌在不同pH的PDA平板上培養(yǎng)3 d后的生長(zhǎng)情況如圖1所示，病原菌在pH值為4～11時(shí)均能生長(zhǎng)，隨著pH的升高病原菌的生長(zhǎng)速度加快，當(dāng)pH為8～10時(shí)，病原菌生長(zhǎng)速度最佳，當(dāng)pH繼續(xù)升高時(shí)，病原菌的生長(zhǎng)變緩。

2.3 氮源和碳源對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響

病原菌在含不同氮源的培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d后的生長(zhǎng)情況如圖2所示，病原菌對(duì)不同氮源的利用率存在顯著差異，由高到低分別為酵母浸出物>硝酸鈉>L-谷氨酸>硝酸鉀>蛋白胨>甘氨酸>硝酸銨>磷酸二氫銨>硫酸銨，對(duì)酵母浸出物的利用率最高，對(duì)硫酸銨和磷酸二氫銨的利用率最低，而對(duì)甘氨酸、硝酸鉀、蛋白胨、L-谷氨酸和硝酸鈉的利用率差異不明顯。由圖3可得，病原菌對(duì)不同碳源的利用也存在一定差異，由高到低分別為甘露醇>麥芽糖>α-乳糖>可溶性淀粉>蔗糖>D-果糖>葡萄糖，對(duì)葡萄糖利用最低，而對(duì)甘露醇、麥芽糖、α-乳糖和可溶性淀粉的利用率均相對(duì)較高。

2.4 殺菌劑對(duì)病原菌抑制作用測(cè)定

由表1可知，在含藥培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d后測(cè)量統(tǒng)計(jì)可得，對(duì)該病原菌的菌絲生長(zhǎng)抑制效果最佳的是稀釋1 000倍的60%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑和稀釋2 000倍的32.5%苯甲嘧菌酯懸浮劑，抑菌率均超過(guò)50%;稀釋600倍的30%噁霉靈水劑、稀釋500倍的30%苯甲·丙環(huán)唑乳油和稀釋1 000倍的38%甲霜福美雙可濕性粉劑對(duì)病原菌的抑菌率達(dá)40%左右;而其他藥劑在推薦使用濃度下對(duì)病原菌的抑制效果較差，其中稀釋500倍的50%多菌靈可濕性粉劑和木霉菌水分散粒劑的抑菌率最低，均未超過(guò)3%。

3 討論與結(jié)論

作為一種藥食兼用型蔬菜，明日葉在營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健功能上具有巨大的開(kāi)發(fā)潛力和應(yīng)用前景[2]。目前，對(duì)明日葉的研究主要在功能營(yíng)養(yǎng)成分等方面，對(duì)其生產(chǎn)種植及病蟲害的關(guān)注相對(duì)較少，隨著明日葉的種植面積日益擴(kuò)大，病蟲害的發(fā)生也開(kāi)始顯現(xiàn)，筆者在前期對(duì)明日葉葉斑病病原菌鑒定的基礎(chǔ)上，對(duì)病原菌的生物學(xué)特性進(jìn)行了測(cè)定，同時(shí)在室內(nèi)進(jìn)行了藥劑篩選，為明日葉葉斑病的防治提供了理論依據(jù)。

鏈格孢是植物病害的一種重要致病菌，在多種植物上引起葉部病害，如中華獼猴桃褐斑病、非洲菊葉斑病、白菜黑斑病、牡丹黑斑病、紅橘褐斑病[12-16]等。本試驗(yàn)中明日葉葉斑病由鏈格孢（Alternaria alternata）引起，對(duì)該病原菌的生物學(xué)特性測(cè)定發(fā)現(xiàn)，其致死溫度為55 ℃，最適pH范圍為8～10，最佳氮源為酵母浸出物，對(duì)甘露醇、麥芽糖、α-乳糖和可溶性淀粉等碳源的利用率均較高，與番茄黑斑病病原菌（Alternaria alternate）的適宜pH和最佳碳氮源相似[17];在室內(nèi)防治藥劑篩選試驗(yàn)中，稀釋2 000倍的32.5%苯甲嘧菌酯懸浮劑和稀釋1 000倍的60%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑對(duì)該病菌的抑制效果最佳，抑菌率均超過(guò)50%，與木薯白點(diǎn)病致病菌鏈格孢的殺菌劑敏感性測(cè)定結(jié)果一致[18]。有研究表明，來(lái)源不同的鏈格孢病原菌對(duì)藥劑的敏感性存在明顯差異[14]，苯醚甲環(huán)唑?qū)σ鹄苯啡~斑病的鏈格孢屬病原菌的抑制作用相對(duì)較好，丙環(huán)唑和苯醚甲環(huán)唑?qū)σ鹩衩状蟀卟〉逆湼矜叩囊种菩Ч草^顯著，與本試驗(yàn)的研究結(jié)果相似。由此可見(jiàn)，三唑類內(nèi)吸性殺菌劑對(duì)鏈格孢抑制效果相對(duì)穩(wěn)定;而異菌脲對(duì)核桃褐斑病和玉米大斑病的防治效果均十分顯著，但前人研究表明，鏈格孢易對(duì)異菌脲產(chǎn)生抗藥性，因此筆者并未對(duì)異菌脲進(jìn)行防治效果進(jìn)行測(cè)定[19-21]。

明日葉葉斑病致病菌適宜在高溫高濕、弱堿性和富含有機(jī)營(yíng)養(yǎng)的條件下生長(zhǎng)，而明日葉性喜涼，生長(zhǎng)適宜溫度為12～22 ℃，因此在不影響明日葉正常生長(zhǎng)的情況下，適當(dāng)降低種植環(huán)境溫度可能對(duì)葉斑病的發(fā)生起到一定防控作用。田間防治藥劑可選擇苯醚甲環(huán)唑等三唑類殺菌劑，但由于環(huán)境因素的影響，田間的防治效果還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

參考文獻(xiàn)

[1] 吳敬章，王磊，張菊平.明日葉的價(jià)值及其開(kāi)發(fā)利用[J].中國(guó)野生植物資源，2015，34（5）：60-61.

[2] 劉暢，王正武，吳金鴻.藥食兼用植物明日葉的研究進(jìn)展及應(yīng)用[J].食品與藥品，2013，15（3）：205-209.

[3] 陸香珍，李群，李子超.明日葉查爾酮制備方法與抗衰老作用研究進(jìn)展[J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2018，39（5）：219-224.

[4] XIE F，WANG Y Q，WU J H，et al.Functional properties and morphological characters of soluble dietary fibers in different edible parts of Angelica keiskei[J].Journal of Food Science，2016，81（9）：2189-2198.

[5] WU J P，ZHOU J，JIAO Z B，et al.First report of Angelica keiskei leaf spots caused by Alternariaalternata in China[J].Plant Disease，2019，103（6）：1426-1426.

[6] OHKURA N，ATSUMI G，OHNISHI K，et al.Possible antithrombotic effects of Angelica keiskei （Ashitaba）[J].Die Pharmazie-An International Journal of Pharmaceutical Sciences，2018，73（6）：315-317.

[7] LEE J，KIM H J，KIM D H，et al.Angelica keiskei improved beta-amyloid-induced memory deficiency of alzheimer's disease[J].The Korea Journal of Herbology，2019，34（3）：1-7.

[8] LEE H，LI H，KWEON M，et al.Isobavachalcone from Angelica keiskei inhibits Adipogenesis and prevents lipid accumulation[J].International Journal of Molecular Sciences，2018，19（6）：1693.

[9] 郭強(qiáng)，馬文清，陳海生，等.廣西崇左市甘蔗梢腐病病原菌的分離鑒定及生物學(xué)特性測(cè)定[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2019，50（8）：1728-1734.

[10] 黃薇，袁斌，萬(wàn)鵬，等.不同鉀鈉比的查氏培養(yǎng)基對(duì)大麗輪枝菌生物學(xué)性狀及致病力的影響[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，55（22）：5815-5820.

[11] 蔣妮，胡鳳云，葉云峰，等.羅漢果新病害斑枯病病原鑒定及防治藥劑室內(nèi)篩選[J].植物保護(hù)，2015，41（6）：173-177.

[12] 趙金梅，高貴田，谷留杰，等.中華獼猴桃褐斑病病原鑒定及抑菌藥劑篩選[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，46（23）：4916-4925.

[13] 劉芳，高原，張競(jìng)頤，等.北京地區(qū)非洲菊葉斑病病原菌鑒定[J].菌物學(xué)報(bào)，2010，29（1）：22-25.

[14] 肖長(zhǎng)坤.白菜種傳黑斑病菌分子鑒定及抑菌藥劑初探[D].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004.

[15] 石良紅，趙蘭勇，吳迪，等.山東牡丹黑斑病的病原菌鑒定與 ITS 序列分析[J].園藝學(xué)報(bào)，2015，42（3）：585-590.

[16] 陳昌勝，黃峰，程蘭，等.紅橘褐斑病病原鑒定[J].植物病理學(xué)報(bào)，2011，41（5）：449-455.

[17] 喬鏡澄，劉宇，馬敬昊，等.番茄黑斑病病原菌的鑒定及生物學(xué)特性研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（10）：94-97.

[18] 蔡吉苗，時(shí)濤，李超萍，等.中國(guó)木薯白點(diǎn)病發(fā)生調(diào)查及病原生物學(xué)特性研究[J].熱帶作物學(xué)報(bào)，2019，40（1）：130-138.

[19] 吳松.涇陽(yáng)線辣椒炭疽病和葉斑病生物學(xué)特性研究及防控藥劑篩選[D].陜西楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2018.

[20] 王芳，李桃，陳文勝.7 種殺菌劑對(duì)玉米大斑病病原菌的毒力測(cè)定試驗(yàn)[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2018，34（22）：132-139.

[21] 張敏.棗縮果病互隔鏈格孢菌侵染特性及抗藥性研究[D].河北保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2018.