篩選菌株S1產海藻酸鈉裂解酶最優條件及其 裂解海藻多糖條件的優化

韓新月　陳營

尋找菌株S1發酵海帶時海藻酸鈉裂解酶活力較高的條件，將海藻酸鈉裂解酶提取并將其接入在不同條件的培養基中，選出能夠裂解海藻多糖和使海帶液化的最佳條件。

方法? 用酶活檢測的方法檢測出菌株S1在何時產生海藻酸鈉裂解酶活力最強;在235nm下檢測海帶發酵液中海藻寡糖的含量。

結果 海帶分解75%時海藻酸鈉裂解酶活力為8.5，內裝有氯化鈉、維氏鹽、氯化銨、30%海帶的三角瓶中且溫度為37℃在160rpm下一直搖動海帶在三天內液化85%。海帶分解75%時海藻酸鈉裂解酶活力較高，在此時提取的海藻酸鈉裂解酶接入內裝有氯化鈉、維氏鹽、氯化銨、30%海帶的三角瓶中且溫度為37℃在160rpm下一直搖動海帶液化速度最快且產生海藻寡糖的量最多。

隨著科技的進步，研究發現海藻寡糖在食品、日用化工、化妝品、醫藥、軍工、農業等領域具有重要意義。如海藻糖可以代替蔗糖用于食品領域，海藻糖與蔗糖相比甜味更為平和，使血糖升高的速度也更為緩慢，海藻寡糖也可以添加到海藻面膜等化妝品中具有良好的保濕效果，在軍工領域海藻寡糖可用于防輻射止血，是天然的好材料，在醫藥領域海藻寡糖可以用于保存生物制劑維持生物大分子的活性，還可以附著在細胞表面維持細胞的活性，在農業領域海藻寡糖可以作為植物生長的營養液使植物具有獨特的生長優勢。獲得海藻寡糖方法主要有物理降解法、化學降解法以及生物降解法。物理法主要采取輻射的方式，操作復雜且降解條件難以控制;化學法目前采用，但存在目標寡糖的產量少，副產物多及回收率低等問題;微生物發酵法條件溫和，成本低、操作簡單，但菌種易污染，微生物利用有益產物導致產量降低。酶特異性降解法具有專一性強、寡糖得率高且條件溫和等優點，目前已報道的海藻寡糖裂解酶可以很快將海藻多糖裂解且得到大量海藻寡糖，因此提取海藻寡糖裂解酶及其作用條件有很大研究價值。本實驗從海帶發酵液中通過酶活檢測找到S1菌何時產生海藻酸鈉裂解酶的酶活最強，并通過微孔濾膜注射器分離出海藻酸鈉裂解酶，并將海藻酸鈉裂解酶應用在不同條件的以海帶為底物的培養基中，挑選出最適合海藻酸鈉裂解酶作用的條件，目的是最大程度地提取和利用以寡糖為主的海帶有效成分。

一、材料與方法

1、 材料

（1）樣品? 采于山東煙臺長島縣海帶養殖場的新鮮海帶。

（2）實驗菌種

S1為得到一株能夠裂解海藻多糖的菌株，我們可以從腐爛的海藻如海帶中尋找，挑取腐爛的海藻在以海藻酸鈉為唯一碳源的選擇培養基中培養平板劃線分離，挑取單菌落接種至另一個相同的培養基中平板劃線，取單菌落接種至海帶富集培養基中，若其能使海帶液化，則證明其為所需要的菌株，然后對其進行16SrRNA鑒定。

（3）培養基? 富集培養基（g/L）：新鮮海帶塊（1 cm2以下）300 g，硫酸銨5 g，氯化鈉10 g，維氏鹽溶液50 mL，pH 6-7（維氏鹽溶液：K2HPO4·3H2O 6.50 g，MgSO4·7H2O 2.50 g，NaCl 2.50 g，FeSO4·7H2O 0.05 g，MnSO4·H2O 0.04 g，蒸餾水1000 mL）。

（3）實驗方法

①海藻酸鈉裂解酶的制備方法

干海帶浸泡四個小時后將海帶切成細小的碎塊，放入500ml三角瓶中，每瓶加入30g海帶碎塊、100ml富集培養基，即海帶濃度為30%。高壓蒸汽滅菌（121℃，30min），取冰箱里保存的海帶發酵液按10%接種量接入富集培養基，設置兩組平行實驗和一組空白實驗。將接種后的富集培養基放入搖床（溫度：37℃、轉速：160rpm）搖瓶培養。與對照組對比，觀察海帶分解程度，并在海帶分解50%、75%、100%、100%放置一天、兩天時，分別取發酵液經5000rpm離心10min后，將上清液經過微孔濾膜注射器過濾除菌后即可制成海藻酸鈉裂解酶粗酶提取液。

②海藻酸鈉裂解酶酶活性及海藻寡糖的含量的檢測方法

檢測海藻寡糖含量的具體方法：取4ml發酵液，在500r/min的離心速下，離心10-15min，然后取1ml上清液液適當稀釋，在235nm處測量其光吸收值，以此值乘上稀釋倍數來代表1ml發酵液中海藻寡糖的含量。

檢測海藻酸鈉裂解酶活性的具體方法：取4ml發酵液，在500r/min的離心速下，離心10-15min，然后取1ml上清液液適當稀釋，測量稀釋后上清液在235nm下OD值然后把稀釋的上清液在40℃水浴中加熱10min，再迅速煮沸15min使酶滅活，再次測量235nm下的OD值。規定：40℃水浴加熱10 min，吸光值增加0.1為一個酶活力單位U。測量前后兩次OD值的差值再乘以稀釋倍數最后除以0.1即為1ml發酵液或反應液的酶活。公式表達為：1ml發酵液的酶活=[（OD值后-OD值前）·稀釋倍數]/0.1

③不同發酵產酶時間對酶解反應的影響

將所制得的酶液按照10%接入量，接入內裝有100ml富集培養基的500ml的三角瓶中。將接入酶液后的富集培養基放入搖床（溫度：37℃、轉速：160rpm）搖瓶培養，進行酶解反應使海帶分解，每隔一天測量一次各組反應液中的酶活及海藻寡糖的含量并且觀察海帶分解情況，一共培養四天。將海帶分解情況拍照記錄并記錄跟蹤檢測的數據，最后選出海帶分解情況最好的一組，由此即可確定哪一海帶分解度時所制得的酶液為使海帶分解的最適酶液。

④體系不同成分對酶解反應的影響

海藻酸鈉裂解酶粗酶提取液與海帶的酶解反應過程中，培養基中的氯化銨、酵母浸膏、海藻酸鈉與細菌生長有關，氯化銨和酵母浸膏中的成分是否影響酶解反應未知。海藻酸鈉裂解酶活性的發揮需要離子為已知。在含有離子（氯化鈉和維氏鹽）的幾組培養基中分別加入酵母膏、硫酸銨、酵母膏和硫酸銨并設置純水對照組，制取海帶發酵分解75%時的海藻酸鈉裂解酶粗酶提取液進行實驗，搖瓶（溫度：37℃、轉速：160rpm）培養三天后觀察各組海帶分解情況并測量各組中的酶活和海藻寡糖含量。

⑤不同溫度與搖動時間對酶解反應的影響

將實驗溫度設置為42℃，設置42℃靜置、42℃分段搖動、42℃一直搖動三個實驗組。由于實驗室條件所限，對照組選擇為1.2.3中的最優組，酶解反應體系成分均采用1.2.3中最優組成分。培養三天后觀察海帶分解度及測定酶活性和海藻寡糖含量。比較數據得出結論找到工藝優化的最適溫度和體系搖動時間。

⑥不同海帶濃度對酶解反應的影響

進行實驗來探究最佳海帶濃度。選擇已經探索并得出結論的最優實驗條件，從起始30%海帶做起，到40%、50%、60%、70%，并設置平行組，最后只看分解效果和測量235nm的OD值。按海帶量的10%接入酶液。放置最優條件下培養三天，觀察各組海帶分解程度。

二、結? 果

1、發酵產酶的最佳時間

將海帶達到各個分解度的發酵液過濾除菌制得無菌的海藻酸鈉裂解酶粗酶提取液，將海藻酸鈉裂解酶粗酶提取液按10%的接入量加入到滅菌后的海帶培養基中搖瓶培養4天，每隔一天檢測一次酶活及海藻寡糖的含量并觀察記錄分解情況。

2、 酶解反應體系的最佳成分

酶解反應體系中的最佳成分是離子（氯化鈉和維氏鹽）和氯化銨，它們的存在可以促進海帶的分解，有利于酶解反應。取各組的反應液離心取上清液檢測反應液中的酶活性及海藻寡糖的含量 ，如表2

3、酶解反應的最適溫度與搖動時

反應體系成分：海帶、氯化鈉、維氏鹽、氯化銨、酶液

分段搖動為每天定時搖動2h

4、酶解反應的最佳海帶濃度

最優實驗條件：溫度：37℃，160r/min，酶促體系成分為氯化鈉、維氏鹽、氯化銨，從起始30%海帶做起，到40%、50%、60%、70%，設兩個平行，最后只看分解效果和測量235nm的光吸收值，按海帶量的10%接入酶液。

三、討論

1、發酵工藝優化分析? 在進行傳統的發酵方法制備海藻寡糖時，我們發現發酵液中海藻寡糖的含量是先上升后下降的，在海帶完全液化分解之時，發酵液中海藻寡糖的含量并非最高。我們的研究目的有兩個，一是盡快使海帶完全分解液化，二是使發酵液中海藻寡糖最高。但由于微生物在分解海藻酸產生海藻寡糖之時也會利用海藻寡糖，所以為了得到盡可能多的海藻寡糖，我們將傳統的發酵法工藝進行優化。優化分為兩個階段，第一階段是海帶發酵階段，此階段的主要目的是制備酶活性最高的無菌海藻酸裂解酶粗酶提取酶液，第二階段的主要目的是利用所制得的酶液使海帶分解產生海藻寡糖。由于第二階段的反應體系中沒有菌體細胞存在，因此只要酶的活性足夠，在底物充足的情況下便會一直積累產生海藻寡糖而無消耗，這樣便可達到工藝優化提高產量的目的。

2、小結? 本次研究收獲的是已經掌握了制備無菌酶液的方法即微孔濾膜除菌法，目前可以制得純凈的無菌酶液。找到了一種測量酶活及海藻寡糖含量的簡便有效的方法，即以發酵液自身來測酶活，測定235nm下的OD值。探索出了海帶發酵分解至75%這一分解度時所制得的粗酶液能夠使固體海帶以最快的速度分解且分解效果徹底。探索出了工藝優化的最佳條件。更為重要的是提高了海藻寡糖的產量，在相同條件下利用工藝優化的方法生產海藻寡糖比傳統菌種發酵的方法產量提高了25%。

（作者單位：264005煙臺大學生命科學學院）