華根霉的研究進展及應用

顏 麗，劉秀河*，李同樂

（齊魯工業大學（山東省科學院）食品科學與工程學院，山東 濟南 250353）

1 華根霉簡介

華根霉（Rhizopus chinonsis）全名中華根霉，屬于接合菌亞門（Zygomyotina）、接合菌綱（Zygomycetes）、毛霉目（Mucorales）、毛霉科（Mucoaceae）、根霉屬（Rhizopus）[1]。近年來經過不斷地研究，華根霉的應用市場越來越廣泛。

華根霉的生長培養基是土豆瓊脂培養基，接種后24 h內長出白色菌絲，菌落疏松擴散；48 h后菌絲變成褐色，假根不發達，短小，手指狀。華根霉主要靠孢子進行無性繁殖，形成的孢子囊球形或近似球形，灰黑褐色至黑色，能產生球形、橢圓形或短柱形的厚垣孢子[2]。華根霉在15～45℃均可生長，但是最適生長溫度為30℃。華根霉能利用大多數的糖類，尤其是乳糖和麥芽糖，但糖的濃度太大反而會影響菌體的生長，華根霉對有機氮源的利用大于無機氮源[3]。

2 華根霉的研究進展

早在1999年，徐巖等[4]就改變了傳統的產脂肪酶的菌株篩選方法，以有機相中合成能力為指標，得到了一株合成己酸乙酯較高的霉菌，命名為Rhizopus Y-92。2003年劉云秀等[2]通過對不同培養基的篩選，再進行多次循環平板劃線分離和稀釋分離，從甜酒曲中分離出華根霉純種。隨著研究的深入，對于華根霉的認識也在不斷加深，目前已有大量文獻報道了華根霉的生理特性，華根霉在生長過程中能產生脂肪酶、淀粉酶、纖溶酶等。

2.1 華根霉產脂肪酶

脂肪酶能將甘油三酯水解成甘油和脂肪酸，而脂肪酸廣泛的應用于食品、藥品、皮革、日用化工等方面[5-6]，因此在工業生產中脂肪酶的需求量非常大，目前脂肪酶的生產渠道之一就是微生物生產。徐巖等[4]在釀酒大曲中分離到一株高產脂肪酶的華根霉菌株，通過條件優化進一步提高了酶活并將脂肪酶用于酯類物質的合成。顏興和[7]對華根霉進行鈷60誘變和亞硝基胍誘變，獲得誘變菌2113，其后對其培養基進行了優化，確定了華根霉2113合成酶活的培養基的最佳營養成分為麥芽糖1%，蛋白胨4%，豆餅粉4%，橄欖油2%，七水合硫酸鎂0.05%，磷酸氫二鉀0.2%，起始pH 5.5，又在此基礎上對華根霉的接種量、裝液量、搖瓶轉速進行了正交試驗，得出（2.2～4.3）×105CFU/30 m L接種量、30 mL裝液量、150 r/min或200 r/min搖瓶轉速的培養條件較有利于華根霉2113脂肪酶的生產，且與出發菌相比，合成酶活提高了534.01%。WANG D等[8]通過改變發酵罐內的攪拌和曝氣來控制發酵液的流型，從而改善混合和傳質，提高了脂肪酶的產量。此外周藝博等[9]在華根霉液態發酵產脂肪酶的發酵條件方面做了相關方向研究，確定在裝液量為20 mL/250 mL，搖床轉速200 r/min，初始pH 5.5，接種量5×107CFU/mL的條件下，30℃發酵72 h，脂肪酶合成活性最高，可達1 080 U/g。

隨著技術的進步，對于華根霉的研究進入了基因時代，王樂樂等[10]通過3次聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）程序克隆首次得到了華根霉CCTCCM201021脂肪酶全基因序列，然后將其導入了畢赤酵母（Pichia pastoris）中，最終得出其產的脂肪酶的酶活比野生型華根霉脂肪酶（Rhizopus chinensis lipase，RCL）的酶活高約43倍。李飛等[11]研究了基因拷貝數和和甲醇濃度對重組畢赤酵母產脂肪酶的影響，結果表明基因拷貝數為5的重組菌發酵產酶能力最高，酶活可達到12 500 U/mL。張謙等[12]又將華根霉脂肪酶基因導入在黑曲霉中進行了重組表達，最終得出所有重組的菌株都能夠進行表達，其中最高的脂肪酶的活力可達到71 U/mL，ZHANG M等[13]分別將脂肪酶轉入大腸埃希菌和畢赤酵母中表達得出畢赤酵母的華根霉r27RCL脂肪酶比在大腸桿菌中產生的華根霉r27RCL脂肪酶活性高1.4倍。隨著研究的深入，趙林水等[14]研究發現，NH4+離子會對重組的畢赤酵母產生一定的影響，YANGM等[15-16]經過研究發現了畢赤酵母在表達的華根霉r27RCLC脂肪酶不會發生糖基化現象但是在畢赤酵母中表達的RCL在14、48、60三個位點會發生N-糖基化。此外，陳剛等[17-18]進一步研究了華根霉產脂肪酶時最高酶活時的壓力與溫度：在200 MPa、40℃條件下酶熱穩定性最佳，壓力超350 MPa時酶熱穩定性顯著降低，繼而又研究了鹽和壓力對RCL的耦合效應，得出在適當的條件下，壓力和鹽可以提高RCL的催化性能和穩定性，高壓對RCL的影響受鹽的影響，同時鹽不能防止高壓引起的RCL損傷等結論。為了進一步提高酶的活性，王睿等[19]篩選華根霉r27RCL脂肪酶分子表面的7對二硫鍵突變位點，利用PCR技術進行定點突變，并在畢赤酵母中表達獲得突變酶，最終得出最佳突變酶在60℃的半衰期提高了4.5倍，Tm值提高了4.2℃，而催化活性保持不變，蔣蕊等[20]還將華根霉CCTCCM201021脂肪酶基因的分子改造，將其氨基酸序列進行了定點突變，從而使其的親和性和催化效率更高，pH適應范圍也更廣。吳厚軍[21]也利用定點突變的方法，通過同源建模和序列比較，對華根霉脂肪酶基因proRCL進行定點突變，構建了突變脂肪酶D190V，使其最適溫度提高了5℃，65℃半衰期提高了一倍。華根霉產脂肪酶的機理機制作為研究的重點，CHEN G等[22-24]研究了壓力誘導下根霉脂肪酶蓋子運動及催化行為的研究，得出在200 MPa和40℃條件下，高壓處理脂肪酶的水解能力經歷了一個先提高后降低的過程，在中等壓力下，壓力處理降低了反應物與過渡態之間的體積，繼而又繼續研究了壓力對于酶的構像的影響，得出當壓力分別為200 MPa和600 MPa時，酶活性位點與底物的結合親和力分別為最高和最低的結論。

2.2 對于華根霉的蛋白質組學研究

隨著深入的研究，蛋白質組學也被用于微生物研究領域，其中雙向電泳技術由于靈敏度高，速度快被廣泛應用[25]。目前，針對絲狀真菌的蛋白質組學主要集中在曲霉上，而鄭禮月等[26-28]首先將蛋白質組學應用于華根霉，并創建和優化了華根霉的胞內蛋白質雙向電泳技術，又在此基礎上研究了華根霉液態發酵菌體形態差異與其產物有一定的聯系，為研究菌體形態與代謝產生的分子機制提供了技術支持。此后郭月[29]又通過雙向電泳技術初步探討了橄欖油對華根霉合成活性脂肪酶及菌體量的影響機制，得出橄欖油可以提高脂肪酶的表達量及酶活。蔡軍等[30]研究了華根霉固態發酵和液態發酵產胞外蛋白酶的比較蛋白質組學分析，研究表明固態和液態不同培養方式影響了華根霉產胞外蛋白的組成，范凱[31]對根霉液態培養生產脂肪酶不同形態菌體的轉錄組的差異進行了分析，得出菌體形態的差異顯著影響了華根霉的轉錄組，從而對其在液態發酵中的產物產生了影響。

2.3 華根霉產其他酶

除了脂肪酶，華根霉也產淀粉酶，纖溶酶和復合酶。劉芳等[32-33]從甜酒小曲中分離出華根霉淀粉酶菌株，并通過紫外誘變得到了菌株酶活力高的優良變株SCLG-華根霉28，接著又通過單因素和正交試驗對其產酶條件進行了優化，最終將其酶活提高了60.96%。汪彬彬等[34]通過Plackett-Burman（PB）試驗和Box-Benhnken Design（BBD）試驗進一步對其發酵培養基進行優化，確定了華根霉產糖化酶的最佳發酵條件為橄欖油0.01%、酪蛋白胨8.14%、麥麩4.32%，該條件下酶活比優化前提高81%。劉曉蘭等[35]從南方小藥酒中分離出的華根霉12#，對其經過固體發酵得到了多種纖維活性成分，并經過多種方式對活性組分進行分離提純，得到電泳純的纖溶酶。YIN J等[36]利用中華根霉12#固態發酵生產飼用復合酶，試驗結果表明中華根霉12#固態發酵生產的飼用復合酶可以用于降低飼料中的某些抗營養因子，改善飼料品質。

3 華根霉的應用

3.1 在釀酒方面

古語有云：“酒香不怕巷子深”，華根霉產的脂肪酶可以催化酸類物質和酒精合成酯類，而酯類是酒中重要的增香物質，對酒類風味的形成至關重要。劉雪等[37]用生物酶法對華根霉合成己酸乙酯的方法進行了研究，通過優化確定了在工廠中合成己酸乙酯的最佳條件，得到的己酸乙酯可達2 302 mg/100 mL。利用脂肪酶具有酯類合成能力的特性，崔如生等[38]制取了一種新的調味酒，而這種調味酒制成的勾兌酒去除了酒精和香料味，窖香濃郁，醇香回甜。

3.2 在合成生物柴油方面

生物柴油是指由動植物油脂與短鏈醇進行轉酯化反應所制備的脂肪酸單酯，生物柴油是一種替代石油柴油的可再生燃料。目前工業生產生物柴油的主要方法是酯交換法，而脂肪酶則可通過酯交換反應生產生物柴油[39-40]。賀芹等[41]首次將華根霉CCTCC M201021全細胞菌體作為催化劑轉化油脂合成生物柴油，得出華根霉全細胞脂肪酶在無溶劑體系中脂肪酸甲酯最高收率可達86.0%以上，在有機溶劑體系中轉酯化反應中脂肪酸甲酯的最高收率為86.7%。

3.3 在化妝品方面

脂肪酶不僅可以合成酯類物質，還可以水解發酵底物中的油脂等。楊敏等[15]用初步篩選得到的含有脂肪酶的華根霉CCTCCM201021全細胞催化油酸與油醇酯化合成油酸油醇酯，并對其的轉換率進行了探索，研究表明，華根霉全細胞脂肪酶對油酸油醇酯合成反應具有很強的催化能力，在優化的反應條件下反應的轉化率可達90%以上。王楠等[42]也用華根霉脂肪酶催化生成乙酸香茅酯并得出合成乙酸香茅酯的最佳條件，最終轉化率達到94%。

3.4 在醫學方面

血栓栓塞性疾病嚴重威脅人類生命和健康，溶栓治療是血栓性疾病安全有效的治療手段，而纖溶酶中血纖維蛋白是溶解血栓的主要成分。遲文鶴[43]利用華根霉TK317固態發酵生產纖溶酶，隨后對編碼華根霉纖溶酶的基因進行克隆，得到編碼該纖溶酶的新基因，并將該基因成功的在大腸桿菌pET系統中進行了表達。王盛楠[44]構建了華根霉全長cDNA文庫，并從中篩選出一種能編碼合成具有水解血纖維蛋白活性基因，通過其在畢赤酵母中的表達，對該酶的酶學性質進行了初步的研究，實驗結果表明其所構建的cDNA文庫質量較高，可長期保存并用于新基因的篩選，且本實驗所得的纖溶酶基因是一種新型纖溶酶基因。

4 華根霉研究存在問題及建議

4.1 在生產方面

華根霉的生產主要有固態發酵和液態發酵兩種方法。固態發酵法具有工藝簡單、發酵條件較為粗放、設備投資及廢物產生較少等特點，但是也存在一些問題，如占地面積大、產量低、操作技術繁瑣、難度大，質量不穩定等[45]。與固態發酵生產相比，液態發酵法具有營養源選擇范圍廣、培養條件易于調控、培養周期短、培養過程雜菌污染率低等優點，但同時液體發酵存在產物雜質較多、發酵后產物提取成本高的問題。針對上述存在問題，結合華根霉自身特性和產酶條件來看，華根霉固態發酵的實用性更大，但是對于華根霉進一步的學術研究，華根霉液態發酵的應用價值更大。

4.2 在釀酒方面

目前來說雖然華根霉在釀酒方面有著重要的作用，但是如果只用華根霉做純種曲釀造出的酒口味較單一，因此必須要添加其他風味物質才能克服自身的不足，所以對于華根霉在釀酒中單獨作用的研究還很少。因此，可以著重于將華根霉與其他菌體混合發酵，取長補短，將各自的優勢發揮出來，這樣既可以提高產品的生產質量，又可以節約成本，提高企業的經濟效益。

4.3 在現代分子技術方面

雖然將華根霉脂肪酶基因進行突變，然后轉入畢赤酵母中進行表達，得到的結果是令人滿意的，但是也存在了一些問題，如很多研究都針對于提高酶活，但對于應用方面研究的不是很多，因此可以在分子技術水平上將華根霉研究成果應用于各個領域，如可以通過分子改造等技術，通過控制華根霉的菌體形態或者優化條件來大幅提高脂肪酶的酶活和產量，這樣就可以使現代發酵工業達到一個新的高度。

4.4 在蛋白質組學方面

目前的蛋白質組學技術主要研究了華根霉固液態培養方式和華根霉的不同形態與其產物有聯系，但是由于其本身的局限性，只能提供一個宏觀的研究方向，對于其微觀聯系以及其內在的機理機制的研究并不清楚，因此可以在此基礎上結合一些其他的技術方法和手段，如基因組學和轉錄組學等，對此進行更進一步的研究。

4.5 展望

隨著人們對華根霉研究工作的深入，華根霉必將在食品、醫學、能源等各個領域中發揮越來越大的作用。文章總結了近年來對于華根霉的研究成果，但目前由于菌種酶活低、生產成本高、技術落后等原因華根霉在國內的應用還比較少，因此我們將來要做的就是采取各種行之有效的高新技術，發展能夠滿足市場需求的新產品。