啤酒中常見異味成分控制的研究進展

崔云前，蘇文超，吳梓萌，張海夢

（齊魯工業大學 生物工程學院 山東省微生物工程重點實驗室，山東 濟南 250353）

伴隨著中國啤酒市場的不斷發展，我國已成為世界啤酒生產大國和消費大國，總產量穩居世界第一[1]。啤酒的發酵是指啤酒酵母利用麥汁中的營養成分進行一系列的代謝反應的過程，在此過程中會產生多種代謝產物，其中最主要的代謝產物是乙醇和二氧化碳，除此之外還有一些代謝副產物如：高級醇、雙乙酰、硫化物、酯類和醛類等物質。研究至今檢測出的成品啤酒中約有1 000多種成分[2]，在這個復雜的成分體系中，會給啤酒風味帶來很大影響的約300余種，但這些物質的總含量所占比例不到0.1%，這些風味物質的種類存在不僅決定了啤酒的種類，而且對啤酒的質量有十分重要的作用。在這眾多的風味物質中，為啤酒帶來不愉悅風味的物質主要是雙乙酰、硫化物與醛類。這些物質中尤為突出的是雙乙酰、二甲基硫（dimethyl sulfide，DMS）和乙醛，它們的含量若在口味閾值范圍內，可為啤酒帶來和諧的香氣、醇厚的口感和良好的風味。若超出這個限定范圍，將會給啤酒帶來令人生厭的異味。這些風味物質的濃度雖然很低，但對啤酒的風味穩定性和一致性有很大影響[3]。

控制這些風味物質的含量是近些年一直在研究的熱門課題。隨著消費者生活水平的提高，對啤酒的風味和質量要求也隨之增強，因此對啤酒中不良風味的控制研究有重要意義。

1 控制啤酒中雙乙酰含量的研究

雙乙酰[4]是啤酒在發酵過程中，酵母發生一系列的復雜代謝反應產生的一種主要副產物，也是啤酒中最主要的生青味物質，其口味閾值在0.10～0.15 mg/L之間，當雙乙酰含量超過口味閾值時。則會產生令人不愉快的餿飯味，將嚴重影響到啤酒的感官質量[5]。雙乙酰的含量與還原程度是判斷啤酒是否成熟的標志，因此如何降低啤酒中雙乙酰的含量，縮短生產周期是啤酒釀造者和科研工作者一直都在關注的課題。

啤酒中雙乙酰的形成方式有以下4種，最主要的是由啤酒酵母通過纈氨酸代謝途徑產生α-乙酰乳酸，然后分泌至細胞外經非酶促氧化脫羧反應形成雙乙酰；酵母中的乙酰輔酶A與活性乙醛發生直接縮合，釋放出輔酶A后形成雙乙酰；在啤酒釀造過程中若污染了乳酸菌和鏈球菌等微生物，則微生物經繁殖代謝后可產生α-乙酰乳酸，導致雙乙酰的形成；到了發酵后期啤酒酵母活性降低，菌體細胞會發生自溶，從而將體內的α-乙酰乳酸溶解到發酵液中，經氧化反應形成雙乙酰[6-8]。

由于雙乙酰的含量與還原程度是判斷啤酒是否成熟的標志，故控制啤酒中雙乙酰的含量是非常重要的。雙乙酰含量的控制主要從減少α-乙酰乳酸的生成、加快α-乙酰乳酸的非酶促氧化分解和加速雙乙酰的還原這三個方面入手[9]。α-氨基酸態氮的含量對酵母的繁殖有重要作用，可通過減少麥汁中α-氨基酸態氮的合成和積累，從而降低α-乙酰乳酸的生成量，研究表明控制麥汁中α-氨基酸態氮的含量在160～180 mg/L之間效果最好。高文舉等[10]研究在啤酒發酵過程中，添加適量的鋅鹽，使發酵液中鋅離子含量達到150μg/L可以增強酵母還原雙乙酰的活力，從而加快雙乙酰的還原。酵母菌株的選擇對雙乙酰的最終含量影響很大。王慶權等[11]對Saccharomyces cerevisiae SH酵母菌株進行超聲波誘變處理，然后通過苯磺隆抗性初篩和發酵復篩得到突變菌株，將之用于啤酒發酵，最終雙乙酰生成量為0.092 mg/L，較出發菌株降低了61.8%，除此之外也保留了出發菌株的優良性狀和良好的遺傳穩定性。石婷婷等[12]通過同源重組敲除四倍體啤酒酵母的α-乙酰乳酸合成酶的部分基因（ILV2），構建缺失兩個ILV2等位基因的突變菌株，并將之運用于啤酒發酵，相比于出發菌株，突變菌株釀造出來的啤酒的雙乙酰峰值降低了51.67%，含量降低了45.65%，且對啤酒質量無其他影響。適量提高酵母接種量和麥汁溶氧量可有效控制酵母增值倍數，使發酵速度加快，有效的降低了α-乙酰乳酸的產生和加快了雙乙酰的還原，經試驗得滿罐接種量維持在（12～16）×108個/mL，麥汁充氧量維持在8～10 mg/L最有利。α-乙酰乳酸脫羧酶（alpha-acetolactate decarboxylase，ALDC）[13]可繞開雙乙酰形成途徑直接將α-乙酰乳酸轉化為乙偶姻，從而降低啤酒中雙乙酰的含量。李愛春等[14]在麥汁主發酵剛開始的時候，向麥汁中添加0.5 g/（h·L）的ALDC產品濃縮液，結果顯示發酵結束后雙乙酰含量明顯降低且縮短了發酵時間，并對啤酒質量無其他影響。發酵過程是雙乙酰含量變化的主要過程，研究表明采用6～7℃較低溫接種，主發酵前期采用8～10℃低溫發酵，當外觀發酵度達到60%～65%時，提高發酵溫度至12～14℃再進行發酵，發酵結束后快速降溫至0～1℃，這個過程可促進啤酒成熟，也利于α-乙酰乳酸的非酶氧化反應和雙乙酰的還原。雙乙酰具有一定的揮發性，故在發酵前期采取加壓發酵，發酵后期利用CO2進行洗滌，因為CO2可使沉降的酵母重新懸浮而加速雙乙酰還原，并且可帶走部分雙乙酰。α-乙酰乳酸只有在有氧的環境下才能形成雙乙酰，所以可在發酵液中添加適量抗氧化劑，如：抗壞血酸、亞硫酸氫鈉等，并嚴格控制灌裝過程中與氧氣的接觸，防止α-乙酰乳酸氧化成雙乙酰。在啤酒發酵的整個流程中，雙乙酰含量的檢測與控制是十分重要的，國標GB/T 4928—2008《啤酒分析方法》規定[15]通過蒸餾的方式將成品啤酒中的雙乙酰蒸餾出來，讓之與鄰苯二胺反應生成2,3-二甲基喹喔啉，用紫光分光光度計在波長335 nm處測定其吸光度值A335nm，帶入公式X（雙乙酸含量）=A335nm×E（換算系數）可計算出雙乙酰的含量。做到定時檢測可為雙乙酰含量的控制提供有效依據。整個釀造環節，要加強衛生管理，建立完善的原位清洗（clean in place，CIP）系統來防止微生物的污染。

2 控制啤酒中二甲基硫含量的研究

啤酒中的硫化物按物理性質可分為非揮發性和揮發性硫化物，前者占94%，對啤酒風味影響較小；后者雖僅占6%，但對啤酒風味影響較大[16]。由此可見啤酒中的硫化味主要來源于啤酒釀造過程中產生的口味閾值較低的揮發性硫化物，這些揮發性硫化物主要有DMS、硫化氫和二氧化硫等，其中DMS對啤酒風味影響最大。DMS對啤酒風味有雙重作用，適量存在時會使酒體豐滿圓潤，香氣協調；過量則會給啤酒帶來不良的風味影響[17]。其口味閾值為30～50μg/L，當其含量適當時對啤酒的口味是非常有利的，超過50 μg/L后會產生“腐爛蔬菜味”、“烤玉米味”[18]，超過100μg/L會出現硫磺臭味，嚴重影響啤酒的風味品質。啤酒受到光照影響時，還會發生霧濁現象。

DMS的生成和整個制麥和啤酒釀造過程都有關系。DMS的前驅物質是活性二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）和非活性硫-甲基蛋氨酸（sulfur-methyl methionine，SMM）。SMM是一種含氮物質，若選用蛋白質含量較高的麥芽則會增加SMM的生成量，從而會增加成品啤酒中DMS的含量。在大麥發芽過程中，大麥中的L-蛋氨酸轉甲基酶活性會大大增強，增加了麥芽胚中SMM的生成量；在麥芽烘干過程中，SMM受熱易降解，故烘干時間越長，溫度越高，SMM被降解越多，從而導致DMS含量越高；在麥芽焙焦過程中，SMM會分解形成游離的DMS和高絲氨酸，焙烤溫度越高，時間越長，則DMS的生成量會越多[19-20]。在糖化期間，溫度、時間和pH也會對DMS的含量造成很大影響，SMM可被水解酶水解成DMS；麥汁導入回旋沉淀槽后，溫度一般維持在90℃以上，此溫度條件下未分解的SMM將繼續在高溫作用下緩慢分解成DMS；麥汁中的大部分DMS會在麥汁煮沸過程中揮發除去，但有少量的DMS會被氧化成DMSO，隨麥汁進入到發酵罐中，發酵過程中在酵母還原酶的作用下被還原成DMS。大腸菌群等微生物的體內有DMSO還原酶，對酵母還原DMSO有很大的促進作用。正常情況下，啤酒酵母只能將5%～15%的DMSO還原成DMS，而污染了細菌后會大大增加這個比例，導致DMS的含量明顯上升。發酵完成后啤酒中還殘留微量的SMM和大量的DMSO，在高溫殺菌作用下，殘留的SMM會緩慢分解成DMS。成品啤酒在貯存運輸過程中受到太陽光的照射也會使DMS的含量有所增加。

若要控制好啤酒中DMS的含量，必須從原料、工藝、設備等全方面嚴加把控才能有效的降低啤酒中DMS的含量[21]。選擇蛋白質含量在9%～11%的大麥品種；選擇還原DMSO能力強、利用二甲基硫化物多、硫酸鹽滲透酶和亞硫酸鹽還原酶活性強的酵母菌株；適當地降低浸麥溫度和發芽溫度，縮短發芽時間會減少SMM的生成，從而降低了DMS的含量[22]。在大麥發芽過程中，使用堿水浸麥和添加溴酸鉀都可抑制蛋白酶活性，減少可溶性氮含量，從而抑制SMM的生成。在糖化過程中，適當增強煮沸強度有利于SMM受熱分解產生的DMS隨著麥汁煮沸蒸發而除去。SMM的水解受pH值影響，麥汁的pH值控制在5.2～5.6范圍內可以減少DMS的生成量。發酵期間采用CO2洗滌可促使發酵液中DMS的排出。采用低溫短時巴氏殺菌。包裝最好采用棕色瓶，可避免日光暴曬。MARCONIO等[23]采用頂空毛細管柱氣相色譜法測定啤酒中DMS的含量，以此實時檢測啤酒中DMS的生成，保證啤酒的風味質量。制麥過程和釀造過程中要加強衛生管理，避免各種微生物的污染。

3 控制啤酒中乙醛含量的研究

乙醛是啤酒中含量最多的醛類物質，具有揮發性，約占啤酒中總醛類物質的60%，其口味閾值為10 mg/L。乙醛對人體影響很大，不僅能刺激人的自律神經使血管擴張或者肌肉萎縮，從而引起過量飲酒后的頭疼感，而且啤酒中的乙醛含量過高會有辛辣的青草味，造成啤酒風味的不協調。

乙醛是酵母把糖轉化為乙醇的中間代謝副產物，在主發酵前期由于酵母的數量急劇增加而使得乙醛大量累積，發酵至外觀發酵度為35%～60%時達到峰值，隨著發酵的繼續進行，導致罐壓升高，乙醛含量開始下降。直到進入低溫貯存期，乙醛含量降至最低且基本保持穩定。啤酒中乙醛的形成機理有以下兩種：主要是啤酒酵母通過糖酵解途徑生成丙酮酸，丙酮酸在丙酮酸脫羧酶的催化作用下生成乙醛，乙醛可在乙醇脫氫酶作用下還原成乙醇，也可在乙醛脫氫酶作用下氧化成乙酸；若麥汁被微生物污染，尤其是厭氧單胞菌，則其可通過2-酮-3脫氧-6-磷酸葡糖酸途徑生成乙醛[24]。在原料選取和釀造工藝方面：麥芽種類和原輔料配比會影響成品啤酒中乙醛含量；麥汁的pH值和溶氧量越高會導致成品啤酒中乙醛含量越高；主發酵壓力越高，乙醛生成量越多；微生物的污染，尤其是厭氧單胞菌會導致乙醛含量的明顯上升[25]。

為了控制啤酒中乙醛含量，可從改進發酵工藝，利用基因工程構建重組菌株和改變啤酒酵母菌株的代謝途徑來進行控制。在改進發酵工藝方面：選擇乙醛峰值低且還原乙醛能力強的酵母；調整原輔料比例為7∶3；麥汁充氧量控制在5～8 mg/L范圍內；麥汁pH控制在5.0～5.2；適當提高發酵溫度，加快乙醛還原速度從而降低乙醛含量；發酵后期采用CO2洗滌可促進乙醛揮發；加強發酵過程中衛生管理，防止微生物的污染[26-27]。利用基因工程構建重組菌株來獲得低乙醛啤酒酵母菌株是降低乙醛含量的一種有效方法。WANG JJ等[28]通過聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術獲取了一段帶有篩選標識和同源區域的目的基因，然后用醋酸鋰轉化法使目的基因與乙醇脫氫酶II基因發生同源重組，得到了一株乙醇脫氫酶II基因被破壞的工業釀酒酵母，此菌株與出發菌株相比乙醛含量明顯降低，且酵母遺傳穩定性良好。王德良等[29]采用基因轉化法獲得了一株乙醇脫氫酶II基因突變型的酵母菌株，馴養后運用到啤酒釀造中，乙醛含量明顯下降。從酵母菌株的乙醛代謝途徑來減少乙醛含量主要有以下三種途徑：（1）通過抑制丙酮酸脫羧酶的活性來減少乙醛的生成；（2）提高乙醇脫氫酶活性來促進乙醛向乙醇的轉化；（3）提高乙醛脫氫酶活性來加快乙醛向乙酸的轉化。金瑋鋆等[30]采用紫外誘變結合高濃度乙醛平板選育的方法篩選出抗乙醛啤酒酵母，并進行低溫發酵實驗，結果顯示此菌株可抵抗高濃度乙醛環境，從而快速還原乙醛，最終成品啤酒中乙醛含量比出發菌株降低了71.13%，且乙醇脫氫酶活性顯著提高，遺傳穩定性良好。張媛媛等[31-32]對酵母菌株進行紫外誘變，然后采用甲吡唑抗性平板與希夫試劑顯色結合法進行篩選，最后得到的酵母菌株在啤酒釀造過程中乙醛含量的降幅為82%，且遺傳穩定性良好。沈楠等[33-35]對酵母菌株進行紫外誘變，經雙硫侖-乙醛平板進行初篩，再將其置于高濃度乙醛培養基中進行連續低溫馴化得到低產乙醛酵母菌株，改良后的酵母菌株在啤酒釀造過程中乙醛含量只有2.86 mg/L，比出發菌株降低了76%。運用乙醛與果糖同時存在時可使間苯二酚顯色的原理去測定啤酒中乙醛含量，從而對啤酒中乙醛的生成進行有效的控制。

4 結論與展望

啤酒的風味一致性與穩定性是由各種風味物質共同作用的結果，其含量過高或過低都會影響啤酒的風味質量，必須采用合理、有效、正確的方法去控制啤酒中雙乙酰、乙醛、二甲基硫的含量，以此改善啤酒風味，提高啤酒質量。

隨著中國啤酒行業的發展以及消費者對啤酒風味、質量要求的提高，應從原料的選擇、糖化、發酵、灌裝等流程嚴加把控。科學技術的發展，使得氣相色譜-質譜聯用法、氣相色譜-嗅覺檢測法、高效液相色譜法及頂空固相微萃取與氣質聯用法等[32]先進檢測技術出現，將之運用于啤酒釀造過程中產生的風味物質的檢測是有重要作用的。故應建立完善的風味物質動態檢測體系，結合現代儀器分析技術，實時監測啤酒生產過程中風味物質的含量，有效地控制啤酒風味的一致性與穩定性，保證啤酒質量，這將是今后啤酒行業發展的必然趨勢。