利用具有抑制霉菌活性的植物乳桿菌生產Cheddar干酪

任志敏，忻勝兵，徐娜，薛惠君，陳忠軍*

1(內蒙古農業大學 食品科學與工程學院，內蒙古 呼和浩特，010018) 2(北京師范大學 附屬實驗中學，北京，100032)

Cheddar干酪起源于16世紀的英國切達郡，是一種硬質全脂干酪，其色澤乳白或淺黃，形狀大多數呈現鼓狀，外層具有天然的布狀外殼，具有細膩的口感和柔和的口味[1-2]。隨著時代的發展，Cheddar干酪已經傳播到世界各地，尤其在歐美國家廣泛被生產和食用，因其口味相對溫和，在國內也備受歡迎[3]。

隨著干酪工藝的不斷發展，產品的防腐與貯藏的問題也變得備受關注。天然防腐劑具有安全性高、高效以及不破壞產品原有品質等優勢，必將逐步代替化學防腐劑[4-5]。乳酸菌作為一種天然防腐劑，其代謝產物可以抑制致病菌和腐敗菌的生長繁殖，可有效延緩產品腐敗變質，延長產品的貨架期[6]。本研究對分離自內蒙古傳統食品中的植物乳桿菌SDZ的抑霉菌活性進行了探究，并對添加該菌株生產Cheddar干酪的工藝進行了優化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料乳

原料乳為益得乳品廠提供的新鮮牛乳。

1.1.2 菌株

發酵用菌：嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)、保加利亞乳酸桿(Lactobacillusbulgaricus)(內蒙古農業大學發酵工程實驗室)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)SDZ(分離自內蒙古傳統發酵食品)。

指示菌：黃曲霉、毛霉、黑曲霉、青霉、婁地青霉、地霉、寄生曲霉(中國微生物菌種保藏管理中心)。

1.1.3 試驗主要試劑

CaCl2、NaCl、檸檬酸氫二銨、凝乳酶：上海國藥集團化學試劑有限公司；牛肉膏、蛋白胨、細菌性蛋白胨，酵母提取粉、瓊脂：廣東環凱微生物科技有限公司；K2HPO4、MgSO4、MnSO4：天津市永大化學試劑開發中心；無水葡萄糖：鴻之惠商貿有限公司。

1.1.4 培養基

MRS培養基：細菌學蛋白胨10 g/L、牛肉膏10 g/L、酵母提取粉5 g/L、檸檬酸氫二銨2 g/L、無水乙酸鈉5 g/L、K2HPO42 g/L、Tween80 1 g/L、MgSO4200 mg/L、MnSO454 mg/L、無水葡萄糖20 g/L，pH值6.5，121 ℃下滅菌20 min。

脫脂乳培養基：脫脂乳粉100 g/L，酵母粉5 g/L，115 ℃下滅菌7 min。

PDA培養基：馬鈴薯300 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂15 g/L，氯霉素0.1 g，pH 6.0，121 ℃下滅菌20 min。

水瓊脂培養基：瓊脂15 g/L，121 ℃下滅菌20 min。

1.2 主要儀器與設備

SW-CJ-1FD超凈工作臺：上海博迅實業有限公司醫療設備廠；RV-10旋轉蒸發儀：艾卡(廣州)儀器設備有限公司；SHB-Ш循環水式多用真空泵：鄭州長城科工貿有限公司；KDC-140HR高速冷凍離心機：安徽中科中佳科學儀器有限公司；GHP隔水式恒溫培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；LDZX全自動高壓滅菌鍋：上海申安醫療器械廠；浦春JY系列電子天平：上海浦春計量儀器有限公司；XH-C漩渦混勻器：常州未來儀器制造有限公司；PHS-3型pH計：上海儀電科學儀器股份有限公司；QTS25質構儀：深圳市科興精密儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 SDZ代謝產物抑菌譜的建立

1.3.1.1 指示菌懸液的制備

將指示菌在PDA斜面劃線后28 ℃培養7 d，在斜面上加入5 mL生理鹽水，在漩渦儀上振蕩均勻，過濾菌絲，收集孢子懸液。利用血球計數板將孢子的濃度調節到106個/mL，備用[7]。

1.3.1.2 制備SDZ代謝產物

將SDZ凍干菌粉接種到MRS培養基中活化。取5 mL活化后的菌液到100 mL MRS培養基中進一步擴大培養。在37 ℃下培養24 h后，取菌液在4 000 r/min條件下離心15 min，取上清液，利用旋轉蒸發儀濃縮20倍，得到SDZ代謝產物。

1.3.1.3 抑菌活性的測定

以霉菌為指示菌，采用牛津杯法測定植物乳桿菌SDZ的抑霉菌活性。將融化好的水瓊脂培養基倒入平板中，待瓊脂凝固后，在培養基上層放入牛津杯。之后將制備的指示菌懸液加入45 ℃的PDA培養基，倒在水瓊脂培養基上。待PDA培養基凝固后，在牛津杯中加入300 μL制備的SDZ代謝產物濃縮液，在28 ℃下培養48 h，測量抑菌圈的直徑(含牛津杯直徑)[8]。

1.3.2 Cheddar干酪制作工藝

原料乳→巴氏殺菌(63 ℃，30 min)→冷卻→添加發酵劑→靜置培養→加凝乳酶(按1 g/10 kg添加)→中速攪拌(5 min)→保溫(32 ℃)→明顯凝乳→切割→熱燙(45 min內升溫至39 ℃緩慢攪拌)→排乳清→堆釀(至排出乳清pH值為5.4)→攪碎→加鹽攪拌→壓榨→包裝

1.3.3 Cheddar干酪感官評價標準

邀請15位有經驗的評委組成感官評分小組，根據Cheddar干酪的整體風味、組織狀態和色澤進行綜合評定，評定時采用百分制，取平均數作為最終分數[9-10]。感官評分標準如表1所示。

表1 干酪感官評分表Table 1 The scoring criteria of cheese sensory evaluation

1.3.4 添加抑制霉菌特性乳酸菌生產Cheddar干酪工藝研究

1.3.4.1 菌種接種比例對Cheddar干酪感官評分的影響

將活化好的嗜熱鏈球菌、保加利亞乳酸桿菌和植物乳桿菌SDZ菌株按照1∶1∶0.25、1∶1∶0.5、1∶1∶0.75、1∶1∶1和1∶1∶1.25的混合比例，以投放量為3%接種于原料乳中，在34 ℃下發酵30 min，根據感官評分確定最佳接種比例。

1.3.4.2 接種量對Cheddar干酪感官評分的影響

按照上述試驗確定的最佳菌種接種比例將活化好的菌株，分別以接種量1%、2%、3%、4%和5%投放到原料乳中，在34 ℃下發酵30 min，根據感官評分確定植物乳桿菌SDZ最佳接種量。

1.3.4.3 發酵溫度對Cheddar干酪感官評分的影響

以最佳菌種比例，將活化好的菌株以確定的最佳接種量投放到原料乳中，分別在28、31、34、37、40 ℃下發酵30 min，根據感官評分確定最適發酵溫度。

1.3.4.4 發酵時間對Cheddar干酪感官評分的影響

將活化好的菌株按照最佳的接種比例和接種量，在最適發酵溫度下分別發酵15、20、25、30、35 min，根據感官評分確定最佳發酵時間。

1.3.4.5 通過響應面分析確定Cheddar干酪最佳工藝

依據單因素試驗結果，對接種比例、接種量、發酵溫度和發酵時間4個影響因素，利用Design Expert 8.0.6軟件設計模型開展響應面分析，獲取最適工藝參數。

1.3.5 干酪理化指標測定方法

1.3.5.1 蛋白質測定

依據GB/T 5009.5—2016中的方法對產品中的蛋白質含量進行測定[11]。

1.3.5.2 脂肪測定

將干燥后的干酪進行研磨，放于濾紙中進行抽提，在抽提管內加入無水乙醚至1/3，6～12 h后取下接收瓶，將濾紙放于干燥箱內進行干燥，稱量測定脂肪含量[12]。

1.3.5.3 水分測定

依據GB 5009.3—2016中的方法測定產品中水分[13]。

1.3.6 干酪的TPA測定

用QTS25質構儀測定樣品的硬度、彈性、凝聚性、膠著性、咀嚼性，回復性，每組樣品反復測定3次，取其平均值。質構儀具體參數設定為：探頭類型為P/50；測量前探頭下降速度為5.0 mm/s；測試速度為1.0 mm/s；下壓變形為50%；觸發力為0.2 N；

1.3.7 防腐效果的驗證

1.3.7.1 防腐效果

將在最佳工藝條件下添加SDZ生產的Cheddar干酪，與傳統菌株生產的Cheddar干酪25 ℃裸露放置貯藏。測定干酪成品的霉菌數，每天連續記錄產品中的霉菌數，從而獲得菌落數指標，觀察其防腐效果[14]。

1.3.7.2 成品干酪中霉菌計數方法

根據GB 4789.15—2016中的方法對霉菌進行計數[15]。

1.3.8 數據處理方法

采用SPSS 19.0對試驗數據進行處理分析，數據表示方式為(平均數±方差)，作圖工具為Origin 7.5。

2 結果與分析

2.1 植物乳桿菌SDZ的抑菌譜

植物乳桿菌SDZ的抑菌譜試驗結果如表2所示。SDZ對毛霉、黃曲霉和黑曲霉抑菌效果較好；對青霉也具有良好的抑制作用；對婁地青霉和寄生曲霉抑制效果一般；對地霉無抑制作用。綜上可知，SDZ對于霉菌有較為廣譜的抑菌性。

表2 抑菌譜Table 2 Antifungal spectrum of strains

注：“+”表示抑菌圈直徑介于7～10 mm；“++”表示抑菌圈直徑介于10～15 mm；“+++”表示抑菌圈直徑介于15～18 mm；“++++”表示抑菌圈直徑大于18 mm；“-”表示無抑菌效果。

2.2 菌種接種比例對Cheddar干酪感官評分的影響

將活化好的嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌和植物乳桿菌SDZ按照不同的比例添加到原料乳中，對制作好的干酪進行感官評定，結果如圖1所示。

圖1 不同接種比例對干酪感官評分的影響Fig.1 Effect of mixed proportion of different strains sensory evaluation of cheese

由圖1可知，不同接種比例對干酪產品的感官評分影響很大。在嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌和植物乳桿菌SDZ的比例為1∶1∶0.5時，制作出的干酪具有良好的感官評分，明顯高于其他接種比例的組分。

2.3 接種量對Cheddar干酪感官評分的影響

將發酵菌株以最佳接種比例，分別添加不同的量制作干酪，并進行感官評定，結果如圖2所示。

圖2 不同接種量對干酪感官評分的影響Fig.2 Effect of different inoculation amount of strain on sensory evaluation of cheese

從圖2可以看出，不同接種量對干酪感官評分影響顯著，發酵菌株添加量為3%時，所得干酪的感官評分明顯高于其他組分。

2.4 發酵溫度對Cheddar干酪感官評分的影響

采用最佳的接種比例和接種量，分別在不同溫度下發酵制作干酪，并對所得干酪進行感官評定，結果如圖3所示。

圖3 不同發酵溫度對干酪感官評分的影響Fig.3 Effect of different temperature on the sensory evaluation of cheese

從圖3可以看出，40 ℃所得干酪與37 ℃所得干酪感官評分明顯高于其他組分，且兩者相差無幾，但考慮到生產實際和成本，采用37 ℃作為最佳發酵溫度。

2.5 發酵時間對Cheddar干酪感官評分的影響

采用最佳的接種比例、接種量和發酵溫度，分別在不同的時間下制作干酪，然后對產品進行感官評定，結果如圖4所示。

圖4 不同發酵時間對干酪感官評分的影響Fig.4 Effect of different fermentation time on the sensory evaluation of cheese

從圖4可以看出，隨著發酵時間的延長，產品的感官評分逐漸升高，在25 min時達到最高，隨著發酵時間的繼續延長，感官評分反而會下降。

2.6 響應面法優化Cheddar干酪制作工藝

2.6.1 響應面優化結果

依據單因素試驗分析結果，以感官評分(Y)為響應值，采用Design Expert 8.0.6設計四因素三水平的Box-Behnken試驗。響應面模型因素與水平設計見表3。Box-Behnken試驗設計與結果如表4所示。

表3 響應面試驗因素水平表Table 3 Factors and their levels of response surface design

表4 Box-Behnken試驗設計與結果Table 4 Response surface design arrangement and corresponding experimental data

2.6.2 回歸方程的建立

利用Design Expert 8.0.6統計分析軟件，對所得4個因素擬合得到感官評定評分(Y)的回歸方程為：

Y=94.30+0.11A+0.86B-0.33C+0.37D-2.33AB-1.00AC-1.70AD-4.75BC-2.75BD-4.95CD-6.38A2-5.36B2-6.60C2-6.07D2

2.6.3 方差分析

應用回歸分析對方程和方程的各因子進行方差分析，分析結果如表5所示。

注：“**”表示極顯著(p<0.01)；“*”表示顯著(0.01

從表5中可知，接種比例、接種量、發酵溫度和發酵時間對干酪感官評分影響極顯著(各二次方項p<0.01)。接種比例與接種量、接種量與發酵溫度、接種量與發酵時間、發酵溫度與發酵時間的交互作用極顯著(p<0.01)，接種比例與發酵時間的交互作用顯著(0.010.05)。

2.6.4 響應面分析及優化

考慮在某兩個因素固定在中心值不變的條件下，另外兩個因素的交互作用對Cheddar干酪感官的影響，繪制出三維立體響應曲面。結果如圖5所示。

圖5 接種比例、接種量、溫度、時間交互作用對 感官評分影響的響應面及等高線Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interaction between mixed proportion of different strains， Inoculation amount，temperature and fermentation time

從圖5可以看出，AC之間交互作用對于感官評分影響不顯著(等高線接近圓形)，其余各因素之間兩兩交互作用對感官評分的影響顯著(等高線為橢圓形)，各因素之間兩兩交互作用對感官評分的影響強度由強到弱依次為：BC>CD>BD>AB>AD>AC，這與方差分析的結果是一致的。

通過該回歸方程求解優化后的最佳工藝參數為：接種比例為1∶1∶0.61，接種量為2.98%，發酵溫度為36.90 ℃，發酵時間為24.80 min，此條件下干酪成品的感官評分可達91.177 4分。經過驗證試驗，此條件下生產干酪的感官評分平均為(92.30±0.83) 分，接近于預測分數，說明模型可以較好地預測實際情況。

2.7 干酪成品理化指標的測定結果

取最優條件下生產的干酪進行理化指標的鑒定，結果見表6。

表6 理化指標測定結果Table 6 The results of physical and chemical indicators

注：小寫字母不同表示組分間差異顯著(p>0.05)。

由表6可以看出，添加植物乳桿菌SDZ生產的干酪與添加傳統菌株生產的干酪水分含量、蛋白質含量差異顯著。由此可以看出添加植物乳桿菌SDZ不會對干酪的理化指標產生較大影響。

2.8 干酪成品TPA測定結果

將在最佳工藝條件下生產的干酪進行質地剖面分析(texture profile analysis, TPA)測定，結果見表7。

表7 TPA測定結果Table 7 The results of TPA measurement

注：小寫字母不同表示組分間差異顯著(p>0.05)。

由7表可以看出，添加植物乳桿菌SDZ在最優工藝條件下生產的干酪硬度適中，彈性好，內聚性良好，膠著性和黏性良好，咀嚼性和回復性都優于傳統菌株生產的干酪。

2.9 抑菌效果研究

將最佳工藝下生產的Cheddar干酪，與傳統菌株生產的Cheddar干酪，在25 ℃下裸露放置，霉菌數測定結果如表8所示。

表8 25 ℃裸露放置干酪成品中霉菌數(CFU/g)測定Table 8 The results of mold populations by exposed treatment during storage at 25 ℃

注：小寫字母不同表示組分間差異顯著(p>0.05)；“-”表示霉菌生長過于多且連成一團，不可計數。

從表8可以看出，傳統菌株發酵生產的Cheddar干酪在25 ℃下裸露放置2 d后，霉菌數就已經超出國標的要求(國標規定霉菌數不得超過50 CFU/g)，而添加SDZ生產的Cheddar干酪在25 ℃下裸露放置5 d后，霉菌數才超標。試驗結果表明，與添加傳統菌株生產的Cheddar干酪相比，添加SDZ可以有效抑制Cheddar干酪的霉菌污染，從而延長產品的貯藏期。

3 結論

植物乳桿菌SDZ對于霉菌有較為廣譜的抑菌性。添加SDZ生產Cheddar干酪的最佳工藝參數為：接種比例1∶1∶0.61，接種量2.98%，發酵溫度36.90 ℃，發酵時間24.80 min，在此工藝參數下所得產品硬度適中，彈性好，內聚性適中，膠黏性良好，感官評分明顯優于對照組。產品的蛋白質含量為15.3%，脂肪含量為22.4%，水分含量為46%，與傳統菌株生產的干酪差別不大。產品在25 ℃下敞口放置霉菌超標的日期高于傳統菌株發酵制得干酪，表明添加植物乳桿菌SDZ可以有效延長干酪的保質期。