雙水相萃取分離α-酮戊二酸

裴瑩，孫玉波，黃斌

(四川理工學院 化學工程學院，化學工程系，四川 自貢，643000)

α-酮戊二酸是一種重要的短鏈羧酸分子，是連接細胞內碳-氮代謝的關鍵節點，能表征細胞中的碳-氮平衡水平，在機體內參與氨基酸、蛋白質、維生素的合成并調控多種能量代謝，比如細胞碳、氮源代謝等調節過程，是一種重要的營養物質，在各個領域都具有廣泛的應用前景[1-4]。α-酮戊二酸可以減輕腎病患者的腎臟負擔、促進患者手術后快速恢復和減少并發癥，因此在醫學領域具有重要的應用價值；α-酮戊二酸能迅速幫助人體補充能量，恢復人體機能，因此在食品領域具有廣泛的應用前景；此外，α-酮戊二酸因為其特殊的化學性質還廣泛應用于化學有機合成領域[5-8]。

目前，化學合成法和微生物發酵法是α-酮戊二酸生產的2種主要方法。但是由于α-酮戊二酸分子中同時存在羰基和羧基的特殊化學結構，使其化學合成工藝路線長而復雜、收率低、生產成本較高，在合成過程中涉及一系列復雜的化學反應過程，并且存在合成原料氰化物有毒以及環境污染等問題[9]，因此制約了化學合成α-酮戊二酸在醫藥、食品等領域的應用。近年來，研究發現微生物發酵法生產α-酮戊二酸具有成本低、產量高、生產過程環保可持續等優點，并且全球非可再生資源的快速消耗和環境問題的日益突出，使得循環利用可再生資源，即利用微生物發酵法[8]生產α-酮戊二酸成為最佳選擇，也成為研究熱點。但發酵法生產α-酮戊二酸的難點是找到一種合適的方法來分離、提純發酵液中的α-酮戊二酸。

雙水相萃取技術近年來日益受到人們的重視，是一種引人注目、極有前途的新型分離技術，與傳統的萃取分離技術相比具有界面張力低、分離迅速，含水量高、操作條件溫和，易于連續操作，分離提純效率高，成本低，過程易于放大，低毒性等特點，因此在生物工程、天然藥物和生物活性物質的分離提取方面有著廣泛的應用[10-14]。目前國內外鮮有對雙水相萃取發酵液中α-酮戊二酸的相關研究，因此本文對雙水相萃取發酵液中α-酮戊二酸進行研究，重點研究無機鹽-低分子有機溶劑形成的雙水相體系[12]萃取發酵液中的α-酮戊二酸。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

α-酮戊二酸發酵液，四川龍蟒福生科技有限責任公司。

異丙醇，重慶川東化工(集團)有限公司；K2HPO4·3H2O,成都市科龍化工試劑廠；α-酮戊二酸(含量≥99%),上海源葉生物科技有限公司；試驗用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

電子分析天平Scout SE,奧豪斯儀器(常州)有限公司；循環水式真空泵SHZ-D(Ⅲ),鞏義市儀器予華儀器有限責任公司；電熱恒溫水浴鍋DK-98-Ⅱ,天津市泰斯特儀器有限公司；雙光束紫外可見光分光光度計DH-2000-BAL,美國海洋光學公司；電熱鼓風干燥箱DHG-9070A,常州普天儀器制造有限公司；家用冰箱BCD-215KJ,青島海爾股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 雙水相萃取基本原理

雙水相萃取是利用物質在互不相溶的2個水相之間分配系數的差異實現分離的分離方法。由于萃取體系的性質不同，在被分離物質進入雙水相體系后，由于分子間的范德華瓦爾斯力、疏水作用、分子間的氫鍵、分子與分子之間電荷作用的存在和環境因素的影響，使其在靜置分層時被分離物質在兩相中的濃度不同，然后將富集了被分離成分的相分離出來，再經過處理后就可得到被分離成分，從而達到分離的目的[15-17]。

低分子有機溶劑-無機鹽雙水相體系成相的基本原理是鹽相與有機相爭奪水分子形成締合水合物[15-17]。溶質在雙水相體系中服從Nernst分配定律，即在一定溫度一定壓強下，如果一個物質溶解在2個同時存在的互不相溶的液體里，達到平衡后，該物質在兩相中濃度比等于常數，分離效果由分配系數來表征。它涉及表面性質(表面自由能)、電荷作用和各種力(如憎水鍵、氫鍵和離子鍵等)等，使其在上、下相中的濃度不同[17-18]。

相關計算公式：

(1)

(2)

(3)

式中：K為分配系數，Ct和Cb分別為α-酮戊二酸在雙水相體系上、下兩相中的濃度(g/L)；R為相比，Vt和Vb分別為雙水相體系上、下相的體積(mL)；E為α-酮戊二酸的萃取效率。

1.3.2 雙水相體系的相圖繪制

水溶液兩相的形成條件和定量關系常用相圖來表示，它是一條雙界線，當兩相的組成位于曲線的上方時體系就會分成兩相[17]。采用濁度法[19-20]繪制雙水相體系的相圖，確定合適的雙水相體系。

圖1 異丙醇/K2HPO4·3H2O雙水相體系相圖Fig.1 Isopropanol/K2HPO4·3H2O aqueous two-phase system phase diagram

由圖1中可以看出，K2HPO4·3H2O與異丙醇形成穩定的雙水相體系，成相范圍較寬。

1.3.3 標準曲線的繪制

在一定濃度范圍內，吸光度與吸光物質的濃度成正比，故以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標作圖，便可得到一條工作曲線或標準曲線。采用雙光束紫外可見光分光光度計，測定α-酮戊二酸標準品的吸光值，確定最佳吸收波長為235.14 nm，并繪制標準曲線(見圖2)，確定標準曲線的回歸方程為C=1.823 92A+0.012 75(R2=0.999 23，α-酮戊二酸溶液質量濃度為0.005～0.25(g/L)時，質量濃度與吸光度呈線性關系。

圖2 α-酮戊二酸標準曲線Fig.2 α-ketoglutarate standard curve

1.3.4 實驗方法

稱取10 g α-酮戊二酸發酵液，分別加入一定比例的異丙醇和K2HPO4·3H2O，攪拌均勻，溶液形成上下兩相，靜置10 min后分液。用移液管分別移取定量的上、下相溶液與容量瓶中，用去離子水稀釋定容，用雙光束紫外可見光分光光度計檢測稀釋一定倍數后的溶液的吸光值。將吸光值對照α-酮戊二酸溶液標準曲線，確定萃取上、下相中α-酮戊二酸的濃度，計算其相比、分配系數、萃取率[21]。采用單因素試驗和正交試驗方法探討萃取過程中各因素對α-酮戊二酸萃取率的影響，并確定最佳的提取分離工藝條件[21-25]。

2 結果與分析

2.1 異丙醇用量的確定

實驗結果表示如圖3所示，α-酮戊二酸的分配系數隨著體系中異丙醇用量的增加呈下降趨勢，原因是隨著異丙醇用量的增加，其競爭締合水分子的能力增強，使得上相爭奪到了更多的水分子，上相體積增加，而下相體積在小范圍內浮動，整體呈下降趨勢，相比上升，而水分進入上相使上相中的α-酮戊二酸被稀釋，濃度降低，且隨著異丙醇用量的增加，過量的異丙醇又會與部分水分子混溶進入下相，一部分α-酮戊二酸分子也會隨之進入下相，使其在下相濃度增加，使得α-酮戊二酸在兩相中的分配系數降低，萃取率降低；同時根據實驗和相圖可知，異丙醇用量不能低于6 g，否則將不能成相。因此在異丙醇用量為6 g時，α-酮戊二酸的萃取率最高，為65.66%。

圖3 異丙醇用量的影響Fig.3 Effects of isopropanol dosage

2.2 磷酸氫二鉀用量的確定

實驗結果表示如圖4所示，α-酮戊二酸的分配系數隨著體系中K2HPO4·3H2O用量的增加呈逐漸下降的拋物線趨勢，原因是隨著K2HPO4·3H2O用量的增加，其競爭水分子的能力增強，使得更多的水分子被吸附競爭到下相，使上相體積減小，下相體積增大，相比降低，并且水分將部分α-酮戊二酸帶入下相，使下相中α-酮戊二酸的濃度升高，大量水分的流失使上相中的α-酮戊二酸被濃縮，濃度上升，但隨著K2HPO4·3H2用量的增加，下相鹽溶液濃度上升，逐漸達到飽和，競爭的水分子逐漸減少，使上相中的α-酮戊二酸被稀釋，濃度降低，最終使得α-酮戊二酸在兩相中的分配系數降低，萃取率降低，所以在K2HPO4·3H2O用量為7 g時，萃取率最高，為80.44%；同時根據實驗和相圖可知，K2HPO4·3H2O用量不能低于7 g，否則將不能成相。

圖4 K2HPO4·3H2O用量的影響Fig.4 Effects of dipotassium hydrogen phosphate trihydrate dosage

2.3 萃取溫度的確定

實驗結果表示如圖5所示，α-酮戊二酸的萃取率隨著萃取溫度的升高，呈下降趨勢。

圖5 萃取溫度的影響Fig.5 Effects of extraction temperature

因為當溫度升高時，分子運動加劇，使得部分丙酮分子溶于下相，使上相體積減小，相比減小，同時隨著溫度升高，分子運動作用使部分α-酮戊二酸分子進入到下相中，使得α-酮戊二酸在上相的濃度降低，在下相的濃度增加，使得分配系數降低，最終使得α-酮戊二酸萃取率下降。并且溫度升高，體系中各分子間的相互作用加強，影響相界面間的傳質加劇以及體系的穩定性，不利于被分離物質的選擇性分配，對萃取不利。該體系在15 ℃時成相不穩定，分相時間略長，當升溫到20 ℃時已無法分相，溶液呈清澈透明狀態，但溫度也不宜過低，零下的溫度也不適用。故選擇5～10 ℃進行萃取比較適宜。

2.4 最佳雙水相體系的確定及驗證

以異丙醇、K2HPO4·3H2O和萃取溫度為3因素進行L4(23)正交試驗，因素水平見表1，試驗結果及計算見表2。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and their coded levels in orthogonal array design

表2 正交試驗設計及結果Table 2 Orthogonal array design and corresponding experimental results

由表1、表2可知，各因素對α-酮戊二酸萃取率的影響大小為：B>C>A；最優工藝條件為A1B1C1，即異丙醇6 g，K2HPO4·3H2O 7 g，萃取溫度5 ℃。

以最佳工藝條件進行三組驗證實驗，數據處理取均值得：相比R=1.281，分配系數K=3.215 5，萃取率E=80.45%。由此可見，在最優工藝條件下，丙酮-硫酸銨雙水相體系對α-酮戊二酸具有比較穩定且較好的分離提純效果。

3 結論

本實驗通過雙水相體系萃取α-酮戊二酸，主要研究了異丙醇用量、K2HPO4·3H2O用量和萃取溫度對α-酮戊二酸分配系數和萃取率的影響，在此基礎上進行了單因素和正交試驗，確定了一種比較穩定的雙水相萃取體系，即：異丙醇-K2HPO4·3H2O雙水相體系提取分離α-酮戊二酸，發酵液用量為10 g，異丙醇用量6 g，K2HPO4·3H2O用量7 g，萃取溫度5 ℃，相比為1.281，分配系數為3.215 5，萃取率可達到80.45%。

采用異丙醇-K2HPO4·3H2O雙水相體系萃取分離α-酮戊二酸，其萃取效率較好，這種低分子有機溶劑和無機鹽的新型雙水相體系分離時間短、效率高等優點，且在后續工藝中兩相物質易回收、資源可重復利用，很大程度上地節約了成本。這種雙水相體系萃取α-酮戊二酸還鮮有報道，我們還可以進一步地深入探討。