livin、LRH1、Ki-67在骨肉瘤中的表達及與預后的關系

王偉陽，李輝，劉濤，王翔，楊帆，解杰

華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院創傷中心/急診創傷外科，武漢 430030

骨肉瘤是臨床常見的一種骨惡性腫瘤，從間質細胞系發展而來，腫瘤迅速生長是由于腫瘤是通過軟骨階段直接或間接形成腫瘤骨樣組織和骨組織[1-2]。骨肉瘤患者早期出現血行轉移，嚴重威脅著患者的健康與生命。因此，早期對骨肉瘤患者的病情及預后進行判斷具有重要的臨床意義。有研究發現，細胞正常凋亡受阻可能直接導致骨肉瘤的發生[3]。生存蛋白（livin）是一種新發現的凋亡抑制蛋白，存在于胚胎組織、胎盤和一些惡性腫瘤組織中，調控著膽固醇的平衡及類固醇的生成，對重塑激動蛋白細胞骨架和促進腫瘤細胞的遷移具有重要的作用[4-5]。肝受體同系物1（liver receptor homolog 1，LRH1，又稱NR5A2）在胚胎發育早期參與肝和胰腺的分化[6]。Ki-67是一種與細胞增殖密切相關的核抗原，是反映惡性腫瘤細胞增殖情況的重要指標，其在其他腫瘤中表達情況的報道較多，但在骨肉瘤中表達情況的報道較少[7-8]。以上3種指標均與骨肉瘤的發生密切相關，但其具體意義仍需進行進一步深入研究。本研究通過觀察livin、LRH1、Ki-67在骨肉瘤中的表達情況及對預后的評估作用，旨在為臨床診治骨肉瘤提供參考依據，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2015年2月至2017年2月華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院接受手術治療且經手術病理證實的骨肉瘤患者的臨床資料。納入標準：①骨肉瘤的診斷標準參考文獻[9]，均經病理學檢查證實為骨肉瘤；②具有石蠟標本；③確診后均接受手術聯合化療；④臨床資料完整。排除標準：①合并其他惡性腫瘤；②合并原發性腦、心、肝、腎等器官功能障礙；③合并自身免疫性疾病；④既往有放化療史和免疫治療史。根據納入和排除標準，本研究共納入50例骨肉瘤患者，收集患者的骨肉瘤組織標本50例及相應的癌旁正常組織（距離腫瘤邊緣5 cm）標本50例。50例骨肉瘤患者中，男28例，女22例；年齡7～48歲，平均年齡為（24.15±7.53）歲；腫瘤部位：股骨15例，肱骨10例，脛腓骨13例，其他部位12例；有軟組織浸潤32例，無軟組織浸潤18例。根據預后情況將組織標本分為死亡組（n=15）和生存組（n=35）。

1.2 主要試劑

鼠抗人Ki-67單克隆抗體購于邁新生物技術開發公司；兔抗人livin單克隆抗體購于美國Santa Cruz公司，LRH1抗體購自TaKaRa公司，即用型采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶（streptavidinperosidase，SP）免疫組化試劑盒、二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色試劑盒均由北京中杉金橋生物技術有限公司提供。

1.3 免疫組織化學染色

采用SP免疫組化法檢測livin、LRH1、Ki-67的表達情況。將所有組織標本均采用4%甲醛溶液固定，并均經常規石蠟包埋后連續切片，切片厚度為4 μm，嚴格按照說明書的步驟進行，檸檬酸緩沖液煮沸修復，DAB顯色，蘇木素復染，將蛋白陽性切片作為陽性對照，將PBS液作為陰性對照，顯色后進行脫水、透明、封片和鏡檢。在5個高倍視野（×400）顯微鏡下觀察染色情況。

1.4 免疫組織化學染色結果判定

細胞中見棕黃色細小顆粒，可認定為livin、LRH1、Ki-67陽性染色，根據陽性細胞所占百分比進行評分[10]：0分為≤5%，1分為6%～25%，2分為26%～50%，3分為＞50%。根據染色強度進行評分：0分為不染色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色。將陽性細胞所占百分比得分與細胞染色強度得分相乘，得出最終結果＞3分則判斷表達陽性，≤3分則判斷表達陰性。

1.5 統計學分析

采用SPSS 18.0軟件對數據進行統計分析。計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。骨肉瘤患者死亡的影響因素分析采用Logistic回歸分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 骨肉瘤組織和癌旁正常組織中livin、LRH1、Ki-67陽性表達情況的比較

骨肉瘤組織中livin、LRH1、Ki-67的陽性表達率均明顯高于癌旁正常組織，差異均有統計學意義（P＜0.01）。（表1）

表1 兩種組織中livin、LRH1、Ki-67陽性表達情況的比較[n（%）]

2.2 生存組、死亡組患者骨肉瘤組織中livin、LRH1、Ki-67陽性表達情況的比較

死亡組骨肉瘤組織中livin、LRH1、Ki-67的陽性表達率均高于生存組骨肉瘤組織，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表2）

表2 兩組患者骨肉瘤組織中livin、LRH1、Ki-67陽性表達情況的比較[n（%）]

2.3 骨肉瘤患者死亡的影響因素分析

單因素分析結果顯示：livin、LRH1、Ki-67的表達與骨肉瘤患者的死亡有關（P＜0.01）；多因素分析結果顯示：livin、LRH1、Ki-67的表達是影響骨肉瘤患者死亡的獨立影響因素。（表3）

表3 骨肉瘤患者死亡的影響因素分析

3 討論

骨肉瘤是臨床上常見的骨惡性腫瘤，多發于20歲以下的青少年，最常見的發病部位是股骨遠端和脛骨近端，其發病機制目前尚不十分明確，臨床表現為疼痛、腫塊、跛行等癥狀[11-12]。其病程短且進展迅速，容易發生肺轉移，肺轉移是骨肉瘤患者死亡的主要原因。骨肉瘤細胞的轉移是細胞與細胞外基質相互作用的過程，包括腫瘤細胞的異常增殖、細胞外基質成分的降解及腫瘤細胞的遷移等[13-14]。

livin是最新發現的人凋亡抑制蛋白家族中的一種蛋白因子，是凋亡抑制蛋白家族的重要成員，在細胞凋亡的基因調控中發揮重要的作用[15-16]。研究顯示，livin在正常組織細胞中呈低表達，而在結直腸癌、胃癌等惡性腫瘤細胞中呈高表達，參與了腫瘤細胞的異常增殖，在腫瘤的發生、發展中發揮著重要的作用[17]。在本研究中，骨肉瘤組織中livin的陽性表達率為62.0%，癌旁正常組織中livin的陽性表達率為18.0%，且死亡患者骨肉瘤組織中livin的陽性表達率高達93.3%，單因素分析結果顯示，livin的表達與骨肉瘤患者死亡有關。張黎明[18]的研究結果也表明，骨肉瘤組織中livin的表達水平較高，可作為預測骨肉瘤的分子標志物。分析其原因是因為高表達的livin可能通過某種信號機制對惡變細胞的凋亡進程產生抑制作用，從而使腫瘤細胞產生免疫逃逸。

LRH1能夠調控膽固醇的平衡及類固醇的生成，可通過對新型雌激素調節基因的調控，促進腫瘤細胞的增殖。諸多文獻中提到，LRH1是一種癌基因，其參與了乳腺癌、胃癌和胰腺癌等多種腫瘤的發生、發展。LRH1通過激動細胞骨架的重塑和E-鈣黏蛋白的分解能夠促進乳腺癌細胞的侵襲和遷移[19-20]。本研究結果表明，骨肉瘤的發生與LRH1的高表達有關，與上述研究結果一致。提示LRH1在骨肉瘤中呈高表達，在腫瘤的發生發展及轉移中起到了促進作用。分析其原因是因為LRH1通過MMP9轉錄后失活促進上皮細胞向間質細胞的轉化，而MMP9促進了腫瘤細胞沿溶解的基質部位向周圍組織侵襲，是促進腫瘤細胞侵襲轉移的關鍵酶。

Ki-67是標志增殖細胞核的一種核蛋白，能夠很好地反映腫瘤細胞的增殖，其表達水平越高，表示預后越差；另外，其與細胞周期密切相關，是反映細胞增殖活性的客觀指標[21-22]。本研究結果顯示，Ki-67在骨肉瘤患者中的陽性表達率明顯高于癌旁正常組織（P＜0.01），提示Ki-67能夠反映骨肉瘤細胞的增殖能力，在骨肉瘤的發生、發展、侵襲和轉移中起著重要作用。分析其原因是因為Ki-67的過度表達縮短了骨肉瘤細胞的增殖周期，促進了骨肉瘤細胞的異常增殖。本研究結果還顯示，livin、LRH1、Ki-67與骨肉瘤的預后密切相關，livin、LRH1、Ki-67是骨肉瘤患者預后不良的獨立影響因素。

綜上所述，在骨肉瘤組織中，livin、LRH1、Ki-67的陽性表達率均較高，三者共同參與著腫瘤的發生和發展，對于骨肉瘤診斷和預后評估具有一定的參考價值，值得臨床深入研究與探討。