海洋放線菌天然活性產物的發掘

張曉婷，赫衛清*

（中國醫學科學院 醫藥生物技術研究所 衛健委抗生素生物工程重點實驗室，北京100050）

海洋是生命的發源地，約占地球表面積的71%，是一個開放、多變、復雜的生態系統[1]。海洋相較于陸地具有高鹽、高壓、低溫、缺氧、低營養和無光照等特殊的生境[2]，正是這些特殊的物理、化學因素造就了生命活動的復雜性、物種資源的豐富性、基因功能的多樣性和生態功能獨特性[3]。使得海洋來源的微生物能夠產生結構新穎且具有活性良好的次級代謝天然產物，微生物來源的天然產物在人類疾病的治療過程中發揮著重要作用[4]。在抗生素的廣泛使用之下，細菌的耐藥性迅速增加[5]，多種耐藥菌陸續開始出現，如“超級細菌”耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillinresistant Staphylococcus aureus，MRSA）對絕大多數抗生素不再敏感[6]。2016年的G20峰會列舉影響世界的深遠因素中，特別指出抗生素耐藥性是影響全球經濟的重大挑戰。在規范抗生素使用的同時迫切需要研發新的抗生素來對抗耐藥菌的出現。在生物活性天然產物新來源的不斷探索的過程中，海洋微生物引起了廣泛的關注，并逐漸彌補了土壤微生物來源的不足[7]。

放線菌（Actinomycetes）屬于絲狀革蘭氏陽性細菌，能夠產生多種具有生物活性的次級代謝產物，當前發現的天然抗生素中約有70%產自放線菌[8]。目前陸生放線菌經過幾十年的研發，發現新菌種和新的活性化合物的幾率正在逐漸降低，因此海洋放線菌正逐步成為研究熱點。海洋放線菌種類很多，最常見且研究最多的就是鏈霉菌屬（Streptomyces）[9]；鏈霉菌是一類具有絲狀分枝細胞，染色體呈線狀的革蘭氏陽性細菌，與其他細菌相比，高鳥嘌呤（guanine，G）、胞嘧啶（cytosine，C）含量是其顯著特點。鏈霉菌基因組是目前已知的最大的原核基因組，生理結構復雜使得鏈霉菌具有較為復雜的發育分化過程，形態分化的同時伴隨著復雜的生理變化和大量次級代謝產物的生成。使海洋放線菌成為未來新天然藥物開發的一大資源寶庫[10]。

目前海洋藥物的開發受眾多因素的限制，最主要的是因實驗培養條件有限，利用傳統培養的方法所分離到的海洋微生物低于百分之一[11]，提高海洋微生物的分離培養效率是開發好樣藥物首要解決的問題，首先需要對傳統培養條件進行不斷優化；再者開發研究新型培養技術，例如運用模擬自然環境的稀釋培養技術來分離篩選到更多的微生物。除此之外宏基因組學和生物信息學也被應用到海洋藥物的開發和研究中，通過異源表達、功能基因的篩選、基因組文庫的建立等方法在天然產物發掘中的運用對于可持續利用海洋生物資源具有重要意義。

1 優化培養基

海洋環境營養物質濃度低，一般要比實驗室培養基低幾個數量級，是典型的寡營養環境，海洋微生物往往依賴其共生環境影響其可培養性[12]。JENSEN P R等[13]在培養基中適當的加入海砂和海泥，從而分離到需海水才能生長的高比例海洋特有放線菌。BRUNS A等[14]通過在海洋微生物的分離培養基中添加一定量的環磷酸腺苷（cAMP）、N-丁酰高絲氨酸內酯或含氧己酰-DL-高絲氨酸內酯，使得可培養海洋微生物的數量明顯增加。選擇性的添加放線菌酮、萘啶酸可以抑制真菌和革蘭氏陰性菌的生長，由此可以分離出生長相對緩慢的放線菌。因對不同微生物培養條件（尤其是培養基配方）知之甚少，阻礙微生物的分離培養。OBERHARDT M A等[15]結合NCBI的微生物分類和微生物培養基數據庫（DSMZ）等，建立了網址http：//komodo.modeleseed.org，依據傳遞預測模式（transitive prediction schema）和協同過濾預測（collaborative filtering predictor）。即根據16S rDNA系統進化相似性，根據已知培養基的物種來推斷其近緣物種的培養基，大大加速從生態研究到微生物資源的進程。

2 改進培養方法和檢測技術

除了摸索各種新型發酵培養基以及對發酵技術的不斷優化，許多研究者也不斷嘗試研發新的培養方法，但大多是模擬自然環境和稀釋培養相結合來提高微生物的可培養性。其次一些靈敏度高的檢出技術運用到海洋微生物活性挖掘中。

2.1 共培養

實驗室人工培養條件下，很多海洋微生物的代謝途徑被抑制甚至不表達，而有效的共培養技術可以幫助人們獲得多樣性更豐富，結構更新穎、活性更顯著的次級代謝產物。而常見的海洋微生物共培養包括海洋真菌和海洋細菌、海洋細菌與海洋細菌、海洋真菌和海洋真菌。共培養的過程中，在培養過程中營養成分的減少、生存空間的不足，會使共培養的海洋真菌或者細菌產生一列次級代謝物。所產生的有些次級代謝產物是單獨培養所不能產生的。如EBADA S S等[16]將一株米曲霉Aspergillus sp.BM05和一株未鑒定的細菌共培養，分離得到一個新的甾醇類的化合物，經證實此化合物對K562、HCT116、A2780、A2780 CisR人腫瘤細胞系具有一定的細胞毒活性。使純培養產生的化合物產量提高，是共培養的另一大優勢，如CHO J Y等[17]將一株海洋來源的細菌Alteromonas sp.KNS-16和一株鏈霉菌Streptomyces cinnabarinus PK209進行共培養時，發現二萜類化合物lobocompactol的產量遠遠高于純培養。

2.2 模擬自然環境的稀釋培養技術

稀釋培養是最大程度的模擬海洋環境的寡營養狀態，將含微生物的海水或海沙海泥等樣品不斷稀釋，使最后一個稀釋度中的微生物含量極低（1～10個細胞），同時補給于未加改動的環境水體作為稀釋液和培養液。這種培養方法傾向于選擇豐度最大而不是營養感應與耐受性最強的微生物。戴欣等[18]發現稀釋培養基上生長的菌量是未稀釋的普通瓊脂培養基上生長的細菌數量的3～5倍，純化菌株也可以通過不斷的稀釋培養獲得。

2.2.1 微包埋技術的運用

微囊包埋技術（microencapsulation）是一種行之有效的、高通量的海洋微生物分離技術，微囊包埋技術是在稀釋培養的基礎上，先將海水和土壤樣品中的微生物稀釋到合適的濃度，然后制成包埋單個微生物細胞的天然或合成高分子材料的微囊進行培養，基本實現一個微球包一個微生物細胞，一方面起保護作用，另一方面被包埋的微生物處于開放的連續補給的環境中可以隨時進行物質交換。AKSELBAND Y等[19]在2005年曾利用微包埋技術從混合樣品中分選到生長緩慢的海洋微生物。

2.2.2 菌落轉移法

菌落轉移顧名思義是在培養過程中將新形成的菌落連續不斷地轉移到新的平板上繼續培養，避免一些寡營養菌在生長延遲期被其他快速生長的菌落所掩蓋，菌落轉移的培養方法使那些生長周期長，長勢弱的非優勢菌株得到生長和分離的機會。EILERS H等[20]通過菌落轉移的方法從表層海水中分離出許多新的浮游菌，觀察到的菌落數是未經菌落轉移的平板的5倍，并且細菌的種系組成也會隨培養時間的延長而發生變化。

2.2.3 模擬環境的擴散盒培養技術

擴散盒兩端封閉于微孔濾膜，將待分離的樣品稀釋后混合含自然海水的瓊脂培養基倒入擴散盒里面的培養室，濾膜只能允許環境中營養物質的通過，但限制了微生物細胞的進出。隨著海水的不斷流動循環，使整體置于類似于自然水體的環境中進行培養。KAEBERLEIN T等[21]對來源于環境中的微生物進行了培養時，發現多達40%的接種細胞在使用擴散盒時獲得了單克隆，連續培養所獲得的微生物的數量是傳統培養方法實現不了的。同時一些難培養的微生物通過反復培養后可以正常生長，提高了物種的多樣性。

2.3 檢出技術的創新

隨著分析處理樣本的增多，傳統的篩選檢測技術已不能滿足需求，需要創造一些高靈敏度的觀察、檢測技術。再者海洋微生物處于寡營養的生存環境[22]，生存周期相對較長，大多數海洋微生物在可見濁度之前便進入生長穩定期。無疑增加了成活率檢出難度，再者加上傳統檢測技術的限制，檢測所得的計算值往往低于真實的成活率。為解決這類問題，近年來發展了一些高通量的分選技術。如LIU W等[23]發明了微流體方法，使培養和分選同時進行，允許單個微生物的分選，孵化和克隆體系的分離，用于更深層次的研究。將流式細胞技術在生物技術最廣泛的應用就是細胞篩選，PORTER J等[24]將流式細胞技術同熒光抗體相結合實現對湖水和污泥樣品中E.coli細胞的分選和富集。除此之外，細菌染色計數、雙鏈核酸染色計數等方法應用于海洋微生物的檢測中，用來提高可培養海洋微生物的比例[25]。

2.4 微生物影像質譜法的應用

質譜成像是以質譜技術為基礎的成像方法。該方法可以通過質譜直接掃描生物樣品成像，將掃描結果傳輸到專業處理軟件，通過對生物組織切片直接分析，可以得到指定質核比相應化合物的密度圖，由此快速、全面、高通量的實現對切片組織中化合物的組成，相對豐度以及分布情況進的分析。在研究微生物相互作用過程中天然產物生產的空間和時間信息方面，影像質譜技術有別于其他檢測技術的優越性。因此近年來成為研究天然產物的有力工具[26]。BARGER S R等[27]嘗試利用影像質譜方法分析Steptomyces sp.Mg1和野生型B.subtilis 3610之間存在相互作用。LIU W T等[28]利用影像質譜技術，從一株生產達托霉素的工業菌株S.roseosporus中分離得到了一種抗感染化合物arylomycin。趙心清等[29]通過影響質譜法對海洋鏈霉菌的研究過程中發現了產多烯類化合物的菌株。

3 從基因層面深度挖掘

海洋微生物可培養技術和檢出技術近年來得到了一定的發展，但仍然無法滿足人類探索海洋的迫切需要，一方面需要創建一些新的更能模擬海洋環境條件的培養方法，為海洋微生物資源的保護和利用提供更多的新菌株；另一方結合宏基因組學、分子生物學技術等先進的技術在基因層面進行深度的挖掘。

3.1 基于16S rRNA的海洋生物多樣性的研究

16S rRNA基因序列作為生物系統發育指標最為合適，其為細菌所共有功能同源且進化最為古老，既含有恒定的保守序列用于設計引物又含可變序列來區別種屬間的差異；再者生物體內為多拷貝存在，分子大小適合遺傳操作；它的序列變化與進化距離相適應具有良好的時鐘性質。目前，16S rRNA 基因序列作為微生物的系統發育和未知菌的鑒定已被廣泛應用于海洋微生物多樣性的研究當中，并取得了一些有意義的結果。戴欣等[30]通過構建16S rRNA基因庫來分析中國南海南沙海區沉積物中的細菌多樣性，發現沉積物樣品中細菌16S rRNA基因序列與基因庫中已知的細菌的16S rRNA 序列差異較大，但主要來自變形細菌和浮霉狀菌目等類群，這一結果表明在中國南沙海區沉積物中潛藏著豐富的微生物資源。

3.2 宏基因組文庫構建

宏基因組是指直接提取樣品的總DNA來獲得特定環境或共生體內所有生物遺傳物質，然后將獲得的遺傳物質克隆到相應的載體上轉入可培養的宿主細胞中，從而構建宏基因組文庫，再從所獲得的重組克隆子中篩選能產生活性物質的相關基因（簇）。是一種不依賴于人工培養的微生物基因組分析技術，克服海洋微生物難培養的問題，極大擴展了海洋微生物資源的利用空間，提高了新活性物質的獲得機會。隨著高通量基因組測序技術的發展以及逐漸降低的測序費用，越來越多的海洋微生物基因組信息被獲得和公開。根據在線基因組數據庫GOLD（Genomes OnLine Database）[31]2018年的更新信息，目前已經測序完成的基因組有295 088個，其中細菌的基因組有261 909個，放線菌登錄基因組有36 773個（http：//www.genomesonline.org）。

3.3 基因篩選

基因篩選方法也被廣泛用于分析海洋微生物合成某些天然產物潛能的研究中，即通過分析某生物合成關鍵酶的保守區域，然后設計相應的兼并引物，進而通過聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增來尋找此關鍵酶的陽性菌株，并獲得特異酶基因的序列，該序列也可作為探針在基因組文庫中篩選陽性菌株，從而找到化合物生物合成基因簇[32]。HORNUNG A等[33]根據合成相關的鹵代酶的氨基酸序列，設計了簡并引物從陽性菌株中克隆了包含鹵代酶基因及與其連鎖PKSII型基因的整個抗生素生物合成基因簇。本實驗室根據鏈霉菌中含糖次級代謝產物的一個糖基脫水酶基因（dTGD）的保守區域設計了一對簡并引物[34]。并對90株海洋來源的微生物進行了dTGD基因的PCR篩選，分析dTGD基因在海洋來源微生物中的分布情況。從所獲得的dTGD基因陽性菌株中選取約50株，對其dTGD基因的PCR產物進行測序，并通過BLAST-p分析預測陽性菌株中潛在含糖天然產物的化學結構類型。但基因篩選方法也存在一定的問題：即兼并引物的設計需依賴現有的酶基因，限制了對新酶基因和未知天然產物的發現；基因簇的分離和生物合成途徑進一步分析還需要與基因組文庫相結合進行；實驗設計的目標酶基因可能只存在于有限種類的菌株中降低了篩選效率等。

3.4 異源表達

用于宏基因組克隆的常用載體有柯斯質粒（Cosmids）、Fosmids、和細菌人工染色體（bacterialartificialchromosome，BAC）。其中前兩者適合中等片段的插入克隆，而BAC常用于大片段的克隆[35]。且BAC克隆株可以在同源和異源宿主中進行功能表達，這在宏基因組克隆中受到廣泛關注。目前作為宏基因組克隆表達的原核生物反應器常用的菌株一是大腸桿菌[36]，但大腸桿菌適合低GC小片段的表達，對于高GC大片段基因表達不太合適；二是鏈霉菌大部分的抗生素都是有鏈霉菌產生的，鏈霉菌具有天然生產機制，編碼次生代謝產物生物合成基因成簇分布。這些分子基礎使得鏈霉菌成為異源表達最好的表達宿主。一個基因簇的完整表達不僅需要具有良好的啟動子、增強子、開放閱讀框等表達元件，還需要合適的物理化學因素誘導，再者與宿主菌株的基因組兼容也是必不可少的因素，這些在實際研究中都需要解決。

4 展望

由于海洋生物與陸地生物生存環境的不同，使得海洋生物次級代謝產物與陸地生物相比有著更大的化學多樣性。解決對陸生微生物來源的藥用先導化合物發現日趨困難的問題，海洋微生物來源次級代謝天然產物成為新藥物先導化合物的研究熱點。一是通過對傳統篩選方法的優化以及培養技術的改進來提高海洋微生物的可培養性。再者推進基因組學的發展，加大海洋微生物基因組測序的力度，利用生物信息學手段全面了解其代謝調控網絡；建立適用于海洋微生物異源表達體系；建立通用的可拆卸/插入的DNA克隆表達元件庫，為應用合成生物學手段改造和構建新的海洋微生物代謝途徑奠定基礎。