長鏈非編碼RNA RPLP0P2在胃癌組織中的表達及對胃癌細胞增殖的影響研究

張海強 陸蓉丹 楊允奔 譚麟

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，位列全球癌癥死因的第3位[1]。胃癌患者如能早期診斷、手術和化療可延長生存期，然而多數(shù)患者確診時已是晚期，失去最佳治療時機[2]。因此，尋找合適的腫瘤標志物對胃癌早期診斷意義重大，但是目前臨床常用的胃癌標志物不多，且靈敏度、特異度也并不理想[3]。長鏈非編碼RNA（LncRNA）是一種新發(fā)現(xiàn)的RNA，已證實在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[4-5]，通過影響轉(zhuǎn)錄、逆轉(zhuǎn)錄過程調(diào)節(jié)基因的表達[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA表達異常是胃癌發(fā)生、發(fā)展的重要機制[8-9]。LncRNA RPLP0P2基因位于人染色體11q12.2上。本研究采用qRT-PCR技術，檢測胃癌組織中RPLP0P2的表達，分析不同臨床病理特征患者RPLP0P2表達水平的差異，并通過轉(zhuǎn)染小干擾RNA（siRNA）行基因敲除的方法觀察RPLP0P2對胃癌細胞增殖的影響，以探討其是否能作為胃癌診治的生物標志物，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 組織標本 選取2011年9月至2012年2月寧波大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院收治的行手術切除治療的胃癌患者56例，患者手術前均未行化療，留取術中切除的胃癌組織與配對的癌旁正常組織，將組織標本浸入RNA固定劑（北京bioteke公司）中，儲存在-80℃環(huán)境中備用。同時收集患者臨床病理資料，包括性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤大小、腫瘤分化程度、TNM分期、Borrmann分型、Lauren分型、癌胚抗原（CEA）、糖類抗原19-9（CA19-9）等。

1.1.2 實驗細胞株 人胃癌細胞株（BGC-823、SGC-7901）及正常胃上皮細胞（GES-1）購自上海生物化學與細胞生物學研究所。使用RPMI 1640培養(yǎng)基（美國Invitrogen公司）進行細胞培養(yǎng)，其含10%FBS，培養(yǎng)溫度37°C，二氧化碳濃度 5%。

1.2 方法

1.2.1 胃癌組織與癌旁正常組織RPLP0P2表達水平檢測 采用qRT-PCR法。使用Trizol液（美國Invitrogen公司）提取胃癌組織、癌旁正常組織的總RNA。分光光度計（美國Denovix公司）檢測總RNA濃度。光密度（OD）260/OD280值約1.8認為提取的總RNA質(zhì)量良好。然后，使用GoScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Promega公司）將2μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；用80μl無RNA酶的蒸餾水稀釋cDNA；使用5μl cDNA在PCR儀（美國Stratagene公司）上進行qRT-PCR反應，以3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）為對照，以ΔCt值反映RPLP0P2表達水平。RPLP0P2、GAPDH引物序列由上海生工生物技術公司合成。RPLP0P2引物序列：正義鏈5′-TGGGAACCAAGAAGACAAGC-3′， 反義 鏈 5′-GTGGGCGGAGAGGAGTTAT-3′。GAPDH 引物序列：正義鏈 5′-ACCCACTCCTCCACCTTTGAC-3′，反義鏈 5′-TGTTGCTGTAGCCAAATTCGTT-3′。

1.2.2 RPLP0P2對胃癌BGC-823、SGC-7901細胞與正常胃上皮GES-1細胞增殖的影響

1.2.2.1 siRNA的合成 以RPLP0P2序列為基礎，由上海吉瑪制藥有限公司合成穩(wěn)定的化學修飾的siRNA Oligo，用于實驗。RPLP0P2 最有效的 siRNA（si-RPLP0P2）和穩(wěn)定的陰性對照siRNA(si-NC)序列分別為：5′-GCCCUUAAUGCAAAGUGUATT-3′、5′-UUCUCCGAACGUG UCACGUTT-3′。

1.2.2.2 siRNA的轉(zhuǎn)染 將BGC-823、SGC-7901、GES-1細胞接種于6孔板，每孔接種數(shù)量以能在24h內(nèi)使細胞匯合度達到30%～50%為準。將培養(yǎng)液換成1.5ml Opti-MEMI低血清培養(yǎng)基（美國生命科技格林德艾蘭公司）。用500μl Opti-MEMI低血清培養(yǎng)基稀釋并混合si-RPLP0P2和脂質(zhì)體2000，并設立si-NC對照。將500μl復合物加入6孔板中，來回輕柔搖晃混勻。37℃細胞培養(yǎng)箱中孵育4～6h后除去復合物，更換不含雙抗的完全培養(yǎng)基。

1.2.2.3 細胞增殖實驗 向E-plate 96板中加入完全培養(yǎng)液100μl/孔，放入培養(yǎng)箱內(nèi)的實時細胞分析儀（北京順能電子儀器有限公司）中，待計算機程序讀取完背景值后取出[1]。制備分別轉(zhuǎn)染si-RPLP0P2、si-NC后的BGC-823、SGC-7901、GES-1細胞懸液，自動細胞計數(shù)儀（美國貝克曼庫爾特公司）計數(shù)。稀釋細胞懸液，調(diào)整細胞濃度至5×104個/ml。向E-plate 96板中加入稀釋好的細胞懸液100μl/孔，靜置30 min后放入實時細胞分析儀中繼續(xù)培養(yǎng)。每組細胞設置8個復孔，實時細胞分析儀每15min檢測1次細胞指數(shù)（CI），以CI反映細胞增殖情況。

1.3 觀察指標 （1）比較胃癌組織與癌旁正常組織RPLP0P2表達水平；（2）比較不同臨床病理特征的胃癌患者胃癌組織RPLP0P2表達水平；（3）比較轉(zhuǎn)染si-RPLP0P2與轉(zhuǎn)染 si-NC 的 BGC-823、SGC-7901、GES-1細胞增殖情況。

1.4 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件；計量資料以表示，胃癌組織與癌旁正常組織RPLP0P2水平比較采用配對t檢驗；不同臨床病理特征的胃癌患者胃癌組織RPLP0P2水平比較采用兩獨立樣本t檢驗或單因素方差分析；轉(zhuǎn)染si-RPLP0P2的細胞與轉(zhuǎn)染si-NC的細胞CI比較采用兩獨立樣本t檢驗；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織與癌旁正常組織RPLP0P2表達水平比較見圖1。

圖1 胃癌組織與癌旁正常組織RPLP0P2表達水平比較（n=56，*P＜0.05）

由圖1可見，胃癌組織RPLP0P2表達水平明顯高于癌旁正常組織RPLP0P2表達水平（P＜0.05）。

2.2 不同臨床病理特征的胃癌患者胃癌組織RPLP0P2表達水平比較見表1。

表1 不同臨床病理特征的胃癌患者胃癌組織RPLP0P2水平比較（ΔCt值）

由表1可見，除Borrmann分型、腫瘤大小以及是否有神經(jīng)侵犯外，不同臨床病理特征的胃癌患者胃癌組織RPLP0P2表達水平比較均無統(tǒng)計學差異（均P＞0.05）。即胃癌患者胃癌組織RPLP0P2表達水平不受患者性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤直徑、腫瘤分化程度、TNM分期、Lauren分型、CEA、CA19-9等影響。

2.3 轉(zhuǎn)染si-RPLP0P2與轉(zhuǎn)染si-NC的BGC-823、SGC-7901、GES-1細胞增殖情況比較見圖2。

圖2 轉(zhuǎn)染si-RPLP0P2與轉(zhuǎn)染si-NC的BGC-823、SGC-7901、GES-1細胞增殖情況比較（n=16；與轉(zhuǎn)染si-NC比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001）

由圖2可見，與轉(zhuǎn)染si-NC相比，轉(zhuǎn)染si-RPLP0P2的胃癌BGC-823、SGC-7901細胞與正常胃上皮GES-1細胞增殖受抑制，即下調(diào)RPLP0P2會抑制細胞增殖。

3 討論

惡性腫瘤是一種發(fā)病機制復雜的疾病，其發(fā)生、發(fā)展是受多種因素的影響。直至今日人們?nèi)匀晃茨芮宄U述其發(fā)生、發(fā)展的具體機制。目前，臨床檢測胃癌的生物標志物主要是CEA和CA19-9，但兩者的靈敏度與特異度均不甚理想[4-5]。尋找靈敏度、特異度更高的胃癌標志物是研究熱點。近年研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要的角色，其通過影響相關基因的表達、干擾信號通路開關發(fā)揮作用[6-7，10]。LncRNA中部分起抑制惡性腫瘤基因的作用，有的則起促進細胞惡變的作用。第一個被發(fā)現(xiàn)的惡性腫瘤相關LncRNA H19，其可以促進惡性腫瘤細胞發(fā)生、發(fā)展，反向調(diào)節(jié)細胞凋亡，使細胞缺氧耐受能力提升以及加速血管生長。

本研究結(jié)果顯示，胃癌患者的胃癌組織中RPLP0P2表達水平明顯高于癌旁正常組織。此外，除Borrmann分型、腫瘤大小以及是否有神經(jīng)侵犯外，不同臨床病理特征的胃癌患者胃癌組織RPLP0P2表達水平比較均無統(tǒng)計學差異。即胃癌患者胃癌組織RPLP0P2表達水平不受患者性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤直徑、腫瘤分化程度、TNM 分期、Lauren分型、CEA、CA19-9等影響。

本研究以si-RPLP0P2轉(zhuǎn)染胃癌BGC-823、SGC-7901細胞與正常胃上皮GES-1細胞，以敲除RPLP0P2，觀察細胞增殖情況。結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染si-NC相比，轉(zhuǎn)染si-RPLP0P2的胃癌BGC-823、SGC-7901細胞與正常胃上皮GES-1細胞增殖受抑制，即下調(diào)RPLP0P2會抑制細胞增殖。這表明，RPLP0P2可能使胃癌發(fā)生的癌基因。

綜上所述，RPLP0P2在胃癌組織中表達上調(diào)，下調(diào)RPLP0P2可抑制胃癌細胞增殖。RPLP0P2或可成為胃癌的生物標志物與潛在的治療靶點。