天麻素對(duì)大鼠恐懼條件化及消退的影響

劉曉艷 黃伏連 陽澤華

（益陽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校生理學(xué)教研室，湖南 益陽 413000）

天麻是我國傳統(tǒng)中藥材，為蘭科天麻屬植物天麻的塊莖，《本草綱目》記載天麻能治療“語多恍惚，善驚失忘”等癥。天麻素是從天麻中提煉出的主要活性成分，化學(xué)名稱：4-羥甲基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷半水合物，分子式為C13H18O7.1/2H2O，分子量為295.29[1]。有研究證明天麻素可以保護(hù)缺血缺氧導(dǎo)致的神經(jīng)損傷，影響海馬突觸的形成，改善學(xué)習(xí)記憶等作用[2-4]。目前臨床上常將天麻素注射液和片劑用于中風(fēng)、神經(jīng)衰弱等疾病的防治[5-6]。 恐懼條件化模型是研究創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙的典型動(dòng)物模型，本研究擬觀察天麻素對(duì)大鼠恐懼條件化及消退的影響，具有一定的臨床參考意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：清潔級(jí)成年雄性SD大鼠16只（購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司），體質(zhì)量260～300 g，單籠飼養(yǎng)，溫度濕度恒定，自由取食飲水，自然光照循環(huán)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物：天麻素注射液由上海現(xiàn)代哈森藥業(yè)有限公司提供。天麻素注射液及生理鹽水通過腹腔注射的方式干預(yù)。

1.3 實(shí)驗(yàn)裝置：行為實(shí)驗(yàn)在條件化箱構(gòu)成的場景中進(jìn)行（安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司，型號(hào)ZH-KJ）。條件化箱無頂（40 cm×40 cm×50 cm），為黑色不透明的有機(jī)玻璃材料，地板由直徑為8 mm的23根銅桿構(gòu)成，每兩根銅桿間距相隔1.5cm，銅桿與電刺激器相連，可提供電擊。條件化置于尺寸為50 cm×50 cm×60 cm的隔音柜中。隔音柜內(nèi)背面安裝風(fēng)扇，提供65 dB的白噪聲。隔音柜天花板上固定音箱以提供聲音刺激，柜內(nèi)由15 W白熾燈照明。計(jì)算機(jī)程序控制聲、電刺激的呈現(xiàn)。每只大鼠放入條件化箱之前，用75%的酒精溶液擦拭條件化箱。

1.4 實(shí)驗(yàn)程序：天麻素組連續(xù)7 d腹腔注射天麻素，每天2次（劑量為20 mg/kg），生理鹽水組連續(xù)7 d腹腔注射生理鹽水，每天2次（劑量為2 mL/kg）。

行為學(xué)實(shí)驗(yàn)分四個(gè)階段進(jìn)行，每個(gè)階段天麻素組與生理鹽水組處理相同。第1天進(jìn)行習(xí)慣化，每只大鼠分別單獨(dú)適應(yīng)條件化箱20 min。第2天進(jìn)行恐懼條件化訓(xùn)練，動(dòng)物放入條件化箱180 s后第一次呈現(xiàn)聲音（4 kHz，80 dB，持續(xù)20 s），在聲音結(jié)束前1 s呈現(xiàn)電擊（0.7 mA，持續(xù)1 s），電擊與聲音同時(shí)結(jié)束，聲音與電擊配對(duì)呈現(xiàn)5次，相鄰兩次聲音間隔時(shí)間為90 s，第5次聲音結(jié)束60 s后將大鼠從條件化箱取出放回鼠籠。第3天恐懼條件化檢測，也是消退訓(xùn)練階段，動(dòng)物放入條件化箱180 s后第一次呈現(xiàn)聲音（4 kHz，80 dB，持續(xù)20 s），沒有電擊，呈現(xiàn)10次，相鄰兩次聲音間隔60 s，第10次聲音結(jié)束60 s后將大鼠放回鼠籠。第4天進(jìn)行消退記憶再現(xiàn)檢測，方法與消退訓(xùn)練階段相同。

僵直是嚙齒類動(dòng)物面臨傷害性刺激時(shí)特有的行為反應(yīng)，表現(xiàn)為動(dòng)物除呼吸運(yùn)動(dòng)外，沒有其他任何動(dòng)作，處于靜止的狀態(tài)。在實(shí)驗(yàn)過程中用秒表記錄每次聲音呈現(xiàn)時(shí)或?qū)⒋笫笾糜诳謶謼l件化相同場景時(shí)大鼠的僵直時(shí)間，是目前檢測恐懼行為常用的指標(biāo)。

1.5 數(shù)據(jù)處理：條件化過程中的每次聲刺激和電擊配對(duì)稱為一個(gè)trial，消退訓(xùn)練和檢測過程中，每次聲音呈現(xiàn)稱為一個(gè)trial。采用雙因素重復(fù)測量的方差分析對(duì)線索性恐懼條件化階段、消退訓(xùn)練階段、消退檢測階段的僵直時(shí)間百分比進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用兩個(gè)獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)對(duì)恐懼條件化階段前180 s的僵直時(shí)間百分比進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)都以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤的形式表示，使用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。顯著水平設(shè)為P＜0.05。

2 結(jié) 果

恐懼條件化階段，天麻素組與生理鹽水組大鼠僵直時(shí)間百分比無顯著性組間差異，但天麻素組與生理鹽水組大鼠僵直時(shí)間百分比組內(nèi)差異顯著（P＜0.05），表明獲得了同等程度的條件化恐懼（圖1）。恐懼條件化后24 h，給予大鼠消退訓(xùn)練，隨著訓(xùn)練次數(shù)增加，兩組大鼠的僵直時(shí)間百分比逐漸下降，組間差異不顯著，但天麻素組與生理鹽水組大鼠僵直時(shí)間百分比組內(nèi)差異顯著（P＜0.05），表明兩組大鼠獲得同等程度的消退（圖2）。消退訓(xùn)練后24 h，再給予大鼠10次單獨(dú)聲刺激呈現(xiàn)，以檢測消退記憶的保持，兩組大鼠的僵直時(shí)間百分比都隨著訓(xùn)練次數(shù)增加而顯著性下降，組間差異不顯著，但天麻素組與生理鹽水組大鼠僵直時(shí)間百分比組內(nèi)差異顯著（P＜0.05，圖3）。以上結(jié)果表明天麻素處理對(duì)大鼠的恐懼條件化、由聲音誘導(dǎo)的線索性恐懼消退及記憶再現(xiàn)沒有影響。

圖1 Percent freezing of gastrodin and saline group during fear conditioning（ ±s，n=8）Sal=Saline group，Gas=Gastrodin group.

圖2 Percent freezing of gastrodin and saline group during fear extinction training（±s，n=8）Sal=Saline group，Gas=Gastrodin group.

圖3 Percent freezing of gastrodin and saline group during fear extinction test （±s，n=8）Sal=Saline group，Gas=Gastrodin group.

圖4 Percent freezing during 180 second duration before the first tone presentation during fear extinction（±s，n=8）Sal=Saline group，Gas=Gastrodin group.*P＜0.05 vs control

通過組間t檢驗(yàn)分析表明：在恐懼消退訓(xùn)練階段第一次聲音呈現(xiàn)前180 s檢測箱場景誘發(fā)的僵直時(shí)間百分比，天麻素組僵直時(shí)間百分比顯著高于生理鹽水組（P＜0.05，圖4）。表明天麻素處理影響了大鼠的長時(shí)程場景性恐懼記憶的形成。

3 討 論

創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙動(dòng)物模型中較為典型的是恐懼條件化模型，該模型主要研究恐懼記憶的獲得及消退的一系列過程[7]。恐懼記憶的消退并不是簡單的對(duì)恐懼記憶的遺忘，其本質(zhì)是恐懼記憶與消退記憶競爭出現(xiàn)，所以恐懼消退是一種新的學(xué)習(xí)過程。動(dòng)物研究證實(shí)前額葉、杏仁核、海馬等多個(gè)腦區(qū)參與了恐懼記憶的形成、消退及再鞏固過程[8-9]。當(dāng)恐懼消退再現(xiàn)過程受阻將會(huì)引起神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病，比如個(gè)體在經(jīng)歷了強(qiáng)烈的創(chuàng)傷性事件后，當(dāng)其再次暴露在遭受創(chuàng)傷時(shí)相似的情境中，會(huì)出現(xiàn)以恐懼記憶重復(fù)體驗(yàn)為核心癥狀的反應(yīng)性精神障礙，稱為創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙（post-traumatic stress disorder，PTSD）[10]。削弱創(chuàng)傷性恐懼記憶再鞏固是PTSD重要治療方法之一。有研究顯示，天麻素可以通過調(diào)節(jié)GABA能神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)發(fā)揮一定的抗焦慮作用[11-12]，并可以提高學(xué)習(xí)能力和促進(jìn)記憶的形成和鞏固[13]。我們的結(jié)果顯示天麻素處理對(duì)大鼠的恐懼條件化、由聲音誘導(dǎo)的線索性恐懼消退及記憶再現(xiàn)沒有影響，但影響了大鼠的長時(shí)程場景性恐懼記憶的形成。海馬為學(xué)習(xí)記憶的關(guān)鍵腦區(qū)，場景恐懼記憶的產(chǎn)生依賴于海馬，同時(shí)海馬也在應(yīng)激調(diào)節(jié)中起重要作用[14-15]。有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，在應(yīng)激狀態(tài)下，機(jī)體通過大量釋放糖皮質(zhì)激素、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素等，或是抑制神經(jīng)發(fā)生、5-HT受體功能及腦源性營養(yǎng)因子，或是損害長時(shí)程增強(qiáng)[16-18]等途徑對(duì)海馬造成影響。天麻素對(duì)大鼠長時(shí)程場景性恐懼記憶的形成是否通過以上某一途徑來影響海馬的功能，有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來證實(shí)。