米發糕的體外模擬胃腸消化特性研究

陳 晨 賈才華 趙思明 格桑卓瑪 張賓佳牛 猛 熊善柏 林親錄

(華中農業大學食品科學技術學院1，武漢 430070)(中南林業科技大學食品科學與工程學院2，長沙 410004)

食品中的多糖、蛋白質等大分子物質在人體內不可被直接消化，然而經體內酶、pH等作用，可降解為小肽、游離氨基酸、單糖等易被消化吸收的物質[1]。食物胃腸消化物的營養成分可作為膳食營養評價的重要手段。米發糕經胃腸消化后，產生小分子活性肽、低聚糖等成分，易被腸道消化吸收而直接在機體內起作用。經不同菌種發酵后，由于微生物產生的酶對米發糕營養物質的作用位點不同，使得其營養成分如肽和糖的組成和結構有差異，導致其生物活性不同[2]。消化使米發糕蛋白質得到充分的降解，在胃腸消化物中暴露出更多具有抗氧化作用的基團[3]。組氨酸、某些酸性氨基酸側鏈和多糖結構中的醇羥基[4]均可以與產生·OH等自由基所必需的金屬離子(如 Fe2+、Cu2+等)絡合，具有抗氧化作用；Trp和Tyr等具有供氫能力的氨基酸可將氫原子給予自由基，導致自由基鏈反應減慢或終止，從而起到抗氧化的作用[5]。

本實驗以實驗室前期研發的專用菌株，以不同組合的發酵劑，發酵制作米發糕，研究發酵劑對米發糕胃腸消化物及活性的影響，探索產生抗氧化活性的機理，確定具有高抗氧化活性的發酵劑。為傳統米發糕的營養特性進行科學評價提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

大米粉(粉狀)，由崗優118型秈米浸泡磨粉制成，收獲于2015年：黃岡東坡糧油集團；羥丙基二淀粉(粉狀)：杭州普羅星變性淀粉有限公司；馬鈴薯預糊化淀粉(粉狀)：北京遠大食品添加劑有限公司；白砂糖(顆粒狀)：市售；安琪耐高糖活性干酵母和甜酒曲(甜味型)：宜昌安琪酵母股份有限公司；ZSM-001卡斯特酒香酵母[6]、ZSM-002植物乳桿菌[7]、ZSM-003米根霉[8]，保藏于中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，于2016年取出，菌株均為凍干菌粉，用前需在固體培養基中活化，并在液體培養基中擴大培養，獲得菌泥作為米發糕發酵劑。

1.2 主要試劑

鹽酸，氫氧化鈉、3，5-二硝基水楊酸、葡萄糖、菲咯嗪、鄰二氮菲、乙醇：國產分析純；DPPH，胃蛋白酶，胰酶，抗壞血酸：sigma公司。

1.3 主要儀器與設備

TDL-5A型離心機：上海菲恰爾分析儀器有限公司；HBSHP-150型生化培養箱：上海精宏實驗設備有限公司；722S 型可見分光光度計：上海精密科學儀器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 米發糕的制作

以大米粉、發酵劑(分別為ZSM-001、ZSM-001與ZSM-002、ZSM-001與ZSM-003、安琪酵母與酒曲)、白砂糖、水等為原料，攪拌均勻，于35 ℃發酵12 h后，注模蒸制而成。

1.4.2 米發糕水解液的制備1.4.2.1 水提液制備

米發糕搗碎加入去離子水(1∶5)，37 ℃搖床4 h后置于沸水浴中10 min，快速冷卻。離心(4 000 r/min，20 min)，過濾，取上清液。

1.4.2.2 體外模擬胃消化過程

米發糕搗碎加入去離子水(1∶5)，用1.0 mol/L鹽酸調節pH至2.0，加入胃蛋白酶(米發糕蛋白質量的4%)，37 ℃搖床恒溫消化2 h。2 h后取樣，pH值迅速調為7.0，置于沸水浴中10 min滅酶，快速冷卻。離心(4 000 r/min，20 min)，取上清液。

1.4.2.3 體外模擬胃腸消化過程

米發糕經過胃消化道酶系消化2 h后，用1.0 mol/L氫氧化鈉調pH值至7.5。然后加入胰酶(加量為米發糕蛋白質量的4%)，在37 ℃搖床恒溫消化2 h。pH值迅速調為7.0，置于沸水浴中10 min 滅酶，快速冷卻，離心(4 000 r/min，20 min)，取上清液。

1.4.3 米發糕水解物成分測定1.4.3.1 可溶性蛋白質含量的測定

取5 mL米發糕水解液，至50 mL離心管，加入少許蒸餾水，均質后定容至40 mL，4 000 r/min 離心10 min，取上清液用Folin-酚試劑法進行測定。

1.4.3.2 可溶性肽含量的測定

用雙縮脲比色法測定米發糕水解液的肽含量[9]。

1.4.3.3 游離氨基酸含量的測定

取液體樣品5～10 mL，加50 mL蒸餾水和5 g左右活性炭，加熱煮沸并過濾，用熱水洗滌活性炭，收集濾液于100 mL容量瓶中。吸取樣品溶液1～4 mL于50 mL比色管中，加pH 5.4乙酸和乙酸鈉緩沖液和2%茚三酮溶液各1 mL，加0.1 mL抗壞血酸，沸水浴15 min，室溫靜置15 min之后，在570 nm下檢測吸光值[10]。

1.4.3.4 總糖含量的測定

吸取一定量的樣品于100 mL錐形瓶中，加5.0 mL 50% HCl，混勻，于70 ℃水浴鍋中水解15 min，冷卻，調pH為7，定容100 mL。吸取樣品水解液1 mL于25 mL比色管中，按照3,5-二硝基水楊酸法測定還原糖含量[11]。

總糖=(還原糖質量×稀釋倍數×100)/樣品體積×100%

1.4.4 米發糕水解物的抗氧化活性的測定1.4.4.1 DPPH自由基清除能力

取1.5 mL樣品溶液，加入1.5 mL 99.5%的乙醇和0.675 mL的0.02%DPPH乙醇溶液混合，振蕩混勻，室溫下避光水浴30 min，然后在517 nm下檢測體系吸光值。吸光值越低，體系的清除DPPH·能力越強。空白即是將1.5 mL樣品溶液換成1.5 mL去離子水[12]。

清除DPPH·能力=[(空白吸光值-樣品吸光值 )/空白吸光值]×100%

1.4.4.2 OH自由基清除能力

取1.0 mL樣品溶液，加入1.0 mL 0.75 mmol/L鄰二氮菲和 2.0 mL pH 7.4 磷酸鹽緩沖液，加入1.0 mL 0.75 mmol/L FeSO4，混合均勻，加入 1.0 mL 0.12% H2O2，37 ℃水浴保溫 60 min，蒸餾水調零測定 536 nm處吸光值。

羥自由基清除率= (AS-AP)/AB×100%

式中： AS為樣品吸光值；AP為1.0 mL 蒸餾水代替樣品，其他反應條件相同；AB為用 2.0 mL 蒸餾水代替樣品和 0.12% H2O2。

1.4.4.3 亞鐵離子螯合力的測定

取1 mL的樣品溶液，加入3.7 mL乙醇和0.1 mL 2 mmol/L的FeCl2溶液混合，再加入0.2 mL 5 mmol/L的菲咯嗪溶液啟動反應。室溫靜置10 min后，在562 nm波長處檢測吸光度。

亞鐵離子螯合能力=[(空白吸光值-樣品吸光值)/空白吸光值]×100%

1.4.4.4 還原能力的測定

取多肽溶液1 mL，加入0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH 6.6)2.5 mL和1%的鐵氰化鉀溶液2.5 mL，充分混和以后，在 50 ℃下，保溫 20 min后加入2.5 mL 10%的三氯乙酸。經充分混合后以3 000r/min離心10 min。取上清液2.5 mL，加入去離子水2.5 mL和0.1% FeCl30.5 mL，混勻后，測定反應液在700 nm處的吸光度值。

1.5 數據統計分析

所有數據采用Excel2013 與SAS9.2、SPSS22.0軟件進行處理和分析。其中顯著性分析采用SPSS處理，P<0.05判定為變化顯著；相關性分析用SAS處理；所有圖表均由Excel處理。

2 結果與分析

2.1 米發糕胃腸消化物的營養成分

2.1.1 米發糕胃腸消化物中可溶性蛋白質含量

米發糕水解液在不同消化階段的可溶性蛋白質含量見圖1。其中，水提液的可溶性蛋白質含量最低，其中JR的可溶性蛋白質含量最高，其次為J、JG、AJ。這是由于乳酸菌對米發糕蛋白質的降解作用強于酵母菌和根霉菌[13]。乳酸菌在短期內迅速繁殖，所產蛋白酶和酸可促使部分蛋白分解和溶出，其所產乳酸是具有α-羥基結構的羧酸，能與多肽鏈上的基團形成氫鍵，也會促進蛋白的溶出[14]。胃消化階段，在胃蛋白酶和酸的作用下，米發糕蛋白質降解，水解為可溶性蛋白和小肽等，消化物中可溶性蛋白質含量相比水提液均有顯著增長，以JR蛋白質含量最高。在胃腸消化后，J和JR的蛋白質含量略有下降，而JG和AJ的蛋白含量增加。

注：大寫字母表示同一消化階段不同種類米發糕間有差異，小寫字母表示同種米發糕不同消化階段間有差異(P<0.05)。J為酵母菌發酵制作的米發糕，JR為酵母菌和乳酸菌發酵制作的米發糕，JG為酵母菌和米根霉發酵制作的米發糕，AJ為安琪酵母和甜酒曲發酵制作的米發糕。余同。圖1 米發糕水解液中可溶性蛋白質含量

2.1.2 米發糕胃腸消化物中可溶性肽含量

發酵過程微生物代謝產生的蛋白酶系和酸促使體系中蛋白質降解，產生小分子多肽。由圖2知，米發糕水提液的肽含量與蛋白質含量相比較高，以J的肽含量最高，經過胃消化，胃蛋白酶和酸性條件使蛋白質進一步降解，JR、JG、AJ肽含量相比水提液顯著增加，以JR的肽含量最高。胃腸消化階段，胰酶中的胰蛋白酶繼續降解蛋白，J、JG、AJ米發糕肽含量與胃消化階段比顯著增加，而JR米發糕肽含量降低，可能是由于胰酶作用，小分子多肽繼續降解成氨基酸導致[15]。

圖2 米發糕水解液中可溶性肽含量

2.1.3 米發糕胃腸消化物中游離氨基酸含量

由圖3可以看出，J、JR、JG、AJ水提液的游離氨基酸含量較低，經過胃消化，游離氨基酸含量均顯著增加，以JR的游離氨基酸含量最高，其次為AJ、JG、J。在胃腸消化階段，游離氨基酸含量大幅度增加，以AJ的氨基酸含量最高，其次為JR。米發糕水提液中的游離氨基酸主要來自于發酵過程中，微生物代謝產生的蛋白酶對大分子蛋白和肽類物質的降解[16]，含量較低。在胃部消化過程中游離氨基酸的釋放較少，而在腸道消化過程中釋放了大量游離氨基酸，說明胰酶對多肽的降解作用較強。

圖3 米發糕水解液中游離氨基酸含量

2.1.4 米發糕胃腸消化物中可溶性總糖含量

由圖4可知，水提組和胃消化組的四種米發糕可溶性總糖含量差異不顯著，而在胃腸消化階段，J、JR、JG、AJ可溶性總糖含量均顯著升高且具有顯著性差異，其中AJ總糖含量最高，其次為JR、J、JG。由于胃蛋白酶和酸對淀粉降解作用不明顯，而胰酶中含有胰淀粉酶，對米發糕中的淀粉有酶解作用，使得從淀粉上脫落下的單糖、二糖等含量增多，使得水解液中可溶性總糖含量大幅度提高[17]。

圖4 米發糕水解液中可溶性總糖含量

2.2 米發糕胃腸消化物的抗氧化活性

2.2.1 DPPH自由基清除能力

不同濃度VC溶液以及四種米發糕水解液的DPPH·清除能力如圖5所示。米發糕水解液的DPPH·清除能力與0.006～0.01 mg/mL VC溶液相當。J、JR、AJ在水提組、胃消化組、胃腸消化組的DPPH·清除能力變化規律相似，且差異不顯著。其中，AJ的DPPH·清除率清除最低。水提液組，JR的DPPH·清除率最高(42.7%)；胃、胃腸消化消化組中JG的清除能力均最高，表明酵母菌和根霉菌制作的米發糕能夠在胃腸消化液暴露出較多的供氫基團，與自由基作用，表現出較強的自由基清除能力[18]。

圖5 米發糕水解液的DPPH自由基清率

2.2.2 羥基自由基清除能力

不同濃度VC溶液以及四種米發糕水解液的·OH清除能力如圖6所示。米發糕水解液的·OH清除能力與0.01～0.04 mg/mL VC溶液相當。水提液組，JR清除·OH的能力最強；經過胃蛋白酶消化后，J、JR、JG、AJ的·OH清除率均顯著提高，分別提高到29.40%、32.19%、25.36%、31.47%；進一步用胰酶消化后，JG和AJ清除·OH的能力仍在進一步的提升，但J、JR的清除率有所下降，清除率最高的為JR。表明酵母菌和乳酸菌制作的米發糕水解物富含供氫體，可清除或抑制自由基[19]。

圖6 米發糕水解液的羥自由基清除率

2.2.3 亞鐵離子螯合能力

如圖7所示，米發糕水解液的Fe2+鰲合能力與0.001～0.006 mg/mL EDTA溶液相當。水提組中，AJ的Fe2+鰲合能力最強，其次是JG、JR、J。胃消化后，Fe2+鰲合能力均增強，其中最高的是JR，其次為JG。胃腸消化后，JR、JG、AJ鰲合Fe2+的能力升高，而J降低。其中，Fe2+鰲合能力最強的是AJ，其次為JR。蛋白質的酸性氨基酸側鏈羧基、多糖的酚羥基、組氨酸等可以與Fe2+形成螯合物，減少機體自由基的產生[20]。表明安琪酒曲和酵母粉、酵母菌和乳酸菌復合制作的米發糕的胃腸水解物中這些活性物質較多。

圖7 四種米發糕水解液的Fe2+鰲合能力

2.2.4 還原能力

反應體系在700 nm處吸光度越大，說明樣液還原能力越強[21]。如圖8所示，米發糕水解液的還原能力接近于0.01～0.06 mg/mL VC溶液的還原能力。水提組中，JR還原能力最高，其次為JG；經胃消化后，還原能力均顯著增加，其中JR還原能力最強，其次為JG、AJ；經胃腸消化后，J、JR還原能力下降，而JG、AJ的還原能力略有升高。其中，JG還原能力最高。發酵時微生物所分泌的各種酶類物質如蛋白酶、糖化酶，加上消化過程，胃蛋白酶和胰酶的作用，使樣品產生更多的還原糖、小肽和氨基酸等物質，使樣品還原能力有不同程度的提高[22]。

圖8 四種米發糕水解液的還原能力

2.3 米發糕胃腸水解物成分和抗氧化活性的相關性

米發糕水提和胃腸消化過程中的蛋白質、多肽、氨基酸、總糖含量與抗氧化活性的相關性如表2所示，·OH清除能力與蛋白質和肽含量呈極顯著正相關關系，與游離氨基酸含量有正相關性，與總糖相關性不大。Fe2+螯合能力與蛋白質、游離氨基酸、總糖含量顯著正相關，與肽含量有正相關性。還原能力與蛋白質含量極顯著相關，與肽含量正相關；DPPH·清除能力與蛋白質、多肽、氨基酸、總糖含量相關性不大。結果表明，米發糕胃腸水解物中的可溶性蛋白質和可溶性肽對清除·OH作用最強[23]，游離氨基酸和可溶性總糖對螯合Fe2作用最強，其對清除DPPH自由基作用均不顯著[24]。

表1 米發糕胃腸水解物成分與抗氧化活性的相關性分析

注：*表示有相關性0.05

3 結論

微生物發酵和胃腸道消化有利于大分子物質降解，促進易于人體吸收的小分子活性物質產生。米發糕胃腸消化物中的水溶性蛋白、肽、游離氨基酸、可溶性糖對·OH清除能力、Fe2+螯合能力、還原能力有不同程度的提高，而對DPPH·的清除作用不大。胃腸水解物中，以水溶性蛋白含量較高時，·OH清除能力、還原能力作用最強，水溶性糖含量較高時，Fe2+螯合能力最強。分子質量較大的蛋白水解物的抗氧化作用較強。采用酵母菌和乳酸菌、酵母菌和米根霉作為發酵劑，可制得抗氧化活性較高的米發糕。