馬齒莧不同溶劑提取物對核桃油的抗氧化動力學研究

陳 凌 駱盧佳 曹巧巧 賀偉強

(嘉興職業技術學院農業與環境分院，嘉興 314036)

核桃油味美醇香、營養豐富, 含亞油酸64.6%、油酸16.3%、α-亞麻酸15.8%[1]、棕櫚酸5.6%、硬脂酸2.2% , 其中不飽和脂肪酸達91.4%[2-3]，必需脂肪酸(EFA) 質量分數達75.8%[4]，并且含有多種生物活性物質；能夠降低血脂、預防心腦血管疾病、抗癌防癌、改善記憶、清除自由基[5-6]。在經濟發達的國家視核桃油為保健專用油, 近年在國際食用油市場上價格達10 000～12 000 美元/t, 且供不應求。但由于核桃油富含不飽和脂肪酸, 在加工、儲藏及銷售過程中極易發生氧化酸敗變質，因此其保藏就顯得尤為重要。目前，食品工業主要使用丁基羥基茴香醚(BHA)、叔丁基對苯二酚(TBHQ)、二丁基羥基甲苯(BHT)和沒食子酸丙醋(PG) 等人工合成抗氧化劑。大量實驗研究表明，它們有一定的毒性和致癌作用，因此越來越多的國家已停止或嚴格限制使用合成抗氧化劑。馬齒莧抗氧化活性的研究主要側重于對人體的抗衰老、預防某些疾病等方面，在核桃油抗氧化的應用還鮮見報道。因此，用藥食兩用植物馬齒莧提取抗氧化成分，研究其活性成分對核桃油的抗氧化作用，為延長核桃油的貨架期和開發出新型保健食用油提供借鑒。本實驗采用烘箱法，將不同溶劑提取的馬齒莧活性成分添加于核桃油中，通過測定不同時間的過氧化值以確定馬齒莧提取物在核桃油中的抗氧化活性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野生馬齒莧采于嘉興職業技術學院校園內，核桃油市場購置新鮮壓榨。95%酒精、葡萄糖、濃硫酸、苯酚、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、碳酸氫鈉均為分析純，維生素E軟膠囊[每粒含維生素E(天然型)100 mg，輔料為明膠、甘油、精致玉米油]：浙江醫藥股份有限公司新昌制藥廠；蘆丁、沒食子酸：國藥集團化學試劑有限公司；Folin-Ciocalteu試劑：上海荔達生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

T6紫外分光光度計；JP-500B-2多功能粉碎機；RE-52C旋轉蒸發儀；KQ-100B超聲波清洗器；202-2A數顯電熱恒溫干燥箱；FD-4冷凍干燥機；Millipore超純水儀。

1.3 方法

1.3.1 馬齒莧活性成分的提取

新鮮馬齒莧洗凈、100 ℃殺青5 min 后70 ℃恒溫干燥，取出后粉碎，石油醚脫脂。脫脂馬齒莧粉用不同溶劑超聲波輔助提取其活性成分，提取工藝見圖1。將濾液真空濃縮后冷凍干燥，制成固體待用。

1.3.2 馬齒莧活性成分含量測定

1.3.2.1 多糖含量的測定。采用苯酚一硫酸法[7]，以葡萄糖作為標準品，繪制標準曲線，求出回歸方程(y=0.010 8x+0.002，R2=0.998 9)。將測得的提取液的光吸收值代入回歸方程，求出樣品的多糖含量。

1.3.2.2 酚類含量的測定。采用Folin-Ciocalteu 方法，以沒食子酸為標準品，比色法測定其總酚的含量。

標準曲線的制作：用超純水溶解0.2 g沒食子酸, 定容至100 mL, 準確移取1 mL稀釋到100 mL，得0.02 mg/mL沒食子酸溶液。分別移取0、1、2、3、4、5、6 mL 沒食子酸標準溶液，到10 mL 比色管中，加入Folin-Ciocalteu 試劑1.0 mL，混勻，3 min后加入20 g/100 mL Na2CO3溶液3 mL，用超純水定容, 置于30 ℃的恒溫水浴鍋中90 min, 顯色后于765 nm波長下測定吸光度，以超純水代替樣品為空白，以吸光度為縱坐標，沒食子酸溶液質量濃度為橫坐標繪制標準曲線，求出回歸方程(y=2.106 4x+0.064 4，R2=0.998 3)。

樣品中總酚含量的測定：取提取液1 mL稀釋到100 mL，再酌情稀釋，測吸光度。將其吸光度代入回歸方程計算馬齒莧提取物中總酚的含量。

1.3.2.3 黃酮含量的測定。采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法，以蘆丁為對照品，分光光度計測定馬齒莧黃酮的含量[8]。繪制蘆丁濃度與吸光度(A)的關系曲線，以吸光值對濃度進行線性回歸分析，求得回歸方程為(y=11.654x-0.006 1，R2=0.999 6)。將測得的提取液的吸光度值代入回歸方程，得到樣品黃酮含量。

圖1 馬齒莧活性成分的提取工藝流程

1.3.3 抗氧化性能實驗

采用Schaal烘箱法，稱30 g 油脂5份置于錐形瓶中，1份為空白對照，3份分別按油重的0.01%、0.02%、0.03%添加馬齒莧活性成分(均為固體直接添加到核桃油中，除了多糖微溶外，其他提取物都溶于核桃油)，另1份按油重的0.02%添加維生素E膠囊里的液體為對比。混合均勻，置于(50±1)℃的恒溫烘箱中，每隔24 h 攪拌并檢測核桃油的過氧化物值(POV)。

1.3.4 過氧化值的測定

過氧化值按國家標準GB/T 5538—2005 的方法測定。

2 結果和分析

2.1 不同溶劑提取馬齒莧活性成分的含量

用1.3.2方法測得的馬齒莧不同溶劑浸提物中活性成分(主要是黃酮、酚類和多糖)的含量見表1。3種溶劑提取物中多糖含量最高的是水提物，酚類含量最高的是丙酮提取物，黃酮含量最高的也是丙酮提取物。醇提物和丙酮提取物3種活性成分的總質量分數超過100%，這是由于一些酚類本身就是黃酮，有重復計算。水提物中3種活性成分的總質量分數不到100%，說明除了這3種成分之外的其他成分含量較多。

表1 馬齒莧不同溶劑提取物中活性成分的含量

2.2 多糖對核桃油的抗氧化性能

從圖2看出， 在(50±1)℃，所試濃度范圍內，馬齒莧多糖對核桃油都有較好的抗氧化性， 抗氧化性活性為：0.02%>0.01%>0.04%，0.01%和0.02%的馬齒莧多糖對核桃油的抗氧化性均比0.02%VE強，8 d后添加0.01%的馬齒莧多糖的核桃油的POV值為0.874 mmol/kg(此時空白對照值為5.172 mmol/kg)，是空白值的16.9%；添加0.02%多糖的POV為0.822 mmol/kg，是空白值的15.9%；添加0.04%多糖的POV為1.630 mmol/kg，是空白值的35.7%；添加0.02%VE的 POV為1.071 mmol/kg，是空白值的20.7%。

多糖是由10個以上多種單糖聚合而成的天然高分子物質，多糖類化合物具有清除自由基、抑制脂質過氧化作用、抑制亞油酸氧化等抗氧化作用[9]。多糖對抑制脂質過氧化的途徑主要有兩種：第一種為多糖結構中的醇羥基與銅、鐵等金屬離子絡合，抑制羥基自由基的產生，影響脂質過氧化的進行，從而抑制活性氧的產生；第二種為多糖分子直接捕獲制止過氧化鏈式反應中產生的活性氧，阻止或減慢脂質過氧化的順利進行[10]。在所試條件下馬齒莧不同溶劑提取物中0.02%馬齒莧多糖對核桃油抗氧化性最好，其次為0.01%馬齒莧多糖，0.03%馬齒莧多糖對核桃油的抗氧化性較差，可能是濃度高時，互相之間形成氫鍵，其抗氧化活性位置羥基減少而降低抗氧化活性。

圖2 不同濃度馬齒莧多糖對核桃油的抗氧化活性

2.3 馬齒莧乙醇提物對核桃油的抗氧化性能

從圖3得知，0.01%和0.02%的馬齒莧醇提物對核桃油的抗氧化性都比0.02%VE強，抗氧化性為：0.01%>0.02%>0.03%，說明馬齒莧醇提物對核桃油的抗氧化性與馬齒莧醇提物的添加量呈負相關性。在(50±1)℃恒溫8 d后添加0.01%的馬齒莧醇提物的核桃油的POV值是空白值的19.1%，0.02%的POV值是空白值的20.6%，最差的是添加0.03%馬齒莧醇提物，其POV值為3.794 mmol/kg，是空白值的86.5%。

圖3 不同濃度馬齒莧乙醇提取物對核桃油的抗氧化活性

醇提物中含量最高的活性成分是酚類，酚類物質結構中具有化學性質較活潑的羥基氫，可以提供氫，可與脂肪在自動氧化反應中產生的游離基結合，中斷脂肪自動氧化的鏈式反應[11]；失去氫的氧原子上未成對電子能與苯環上的π電子云發生共軛效應，這樣，酚自由基的能量就有所降低，不再引發鏈式反應，從而達到抑制脂質過氧化的目的。低濃度(0.01%～0.02%)時醇提物的抗氧化性較強，但質量分數為0.03%時對核桃油的抗氧化性是所試物的濃度范圍內最差的，這是因為植物多酚在適宜濃度范圍內具有較強的抗氧化能力，但高于一定濃度后，其清除自由基能力下降，而促氧化作用逐漸增強[12]。

2.4 馬齒莧丙酮提物對核桃油的抗氧化性能

由圖4可知，在(50±1)℃，所試濃度范圍內，馬齒莧丙酮提取物對核桃油的抗氧化性都比0.02%VE差，而且隨著添加量的增加對核桃油的抗氧化性減弱，8 d后添加0.01%、0.02%、0.03%的馬齒莧丙酮提取物的核桃油的POV值分別是空白值的25.5%、52.7%和78.8%，添加0.02%VE的抗氧化性是空白值的20.7%。

圖4 不同濃度馬齒莧丙酮提取物對核桃油的抗氧化活性

黃酮類化合物可作為自由基受體及鏈終止劑，過渡金屬離子(如Fe2+、Cu2+等)是自由基產生的催化劑，黃酮類化合物具有4-酮基，5-羥基的分子結構，且B 環3′和4′位的連位羥基含有孤對電子[12]，因而能螯合金屬離子使其失去催化作用。馬齒莧丙酮提取物中黃酮和酚類含量是這3種溶劑提取物中最高的，同時活性成分(多糖、酚類和黃酮的總和)含量也是三者中最高的，但它對核桃油的抗氧化性與其他3種相比卻較差，因為高濃度時黃酮類物質往往與糖縮合成“苷”，形成“苷”會明顯降低抗氧化能力[14],高濃度時黃酮和酚類不具有抗氧化作用甚至表現促氧化特性[15-17]。

2.5 馬齒莧水提物對核桃油的抗氧化性能

由圖5可知，在所試條件下馬齒莧水提物對核桃油都有較好的抗氧化性，添加量為0.01%和0.02%的比0.02%VE強，馬齒莧水提物對核桃油的抗氧化性為：0.01%>0.02%>0.03%，說明馬齒莧水提物對油脂的抗氧化性與馬齒莧水提物的添加量呈負相關性。8 d后添加0.01%、0.02%、0.03%的馬齒莧水提物的核桃油的POV值分別是空白值的19.5%、21.3%、24.7%。

圖5 不同濃度馬齒莧水提物對核桃油的抗氧化活性

馬齒莧水提物對核桃油的抗氧化效果僅次于多糖，水提物中多糖的含量為3種溶劑提取物中最高，酚類和黃酮的含量最低，且多糖、酚類和黃酮的含量最接近(見表1)，可能還與低濃度時多糖和黃酮具有協同效應有關[18]，使得馬齒莧水提物、醇提物和丙酮提取物對核桃油的抗氧化性都隨著濃度的增加而減弱。

2.6 一級反應速率常數

根據圖2～圖5中的曲線，求出每條曲線的回歸方程y=kt+b(其中y為過氧化物值、k為一級反應速率常數、t為時間、b為截距)，R2為相關系數[19]，見表2。由R2值看出，馬齒莧不同溶劑提取物對核桃油的氧化性的擬一階速率常數與濃度與濃度間的線性關系均良好。速率常數k越大氧化速率越快，抗氧化效果越差。從表2得出馬齒莧提取物的抗氧化效果為：0.02%多糖>0.01%多糖>0.01%水提物>0.01%丙酮提取物>0.02%水提物>0.03%水提物>0.02%VE>0.01%醇提物>0.03%多糖>0.02%醇提物>0.02%丙酮提取物>0.03%丙酮提取物>0.03%醇提物。

表2 不同質量濃度馬齒莧提取物對核桃油的抗氧化動力學特性

注：時間為1～8 d。

3 結論

在所試濃度范圍內，(50±1)℃，1～8 d的核桃油抗氧化實驗中，馬齒莧多糖、馬齒莧水提物、馬齒莧醇提物和馬齒莧丙酮提取物對核桃油都具有抗氧化性。總體來看馬齒莧多糖對核桃油的抗氧化性最好，其次是馬齒莧水提物，再其次是醇提物，最差的是馬齒莧丙酮提取物。0.01%～0.03%水提物、0.01%～0.02%多糖和0.01%乙醇提取物對核桃油的抗氧化性都優于VE。除馬齒莧多糖外，馬齒莧水提物、醇提物和丙酮提取物對核桃油的抗氧化性都隨著濃度的增加而減弱。