湘西永順產(chǎn)山蒼子精油成分分析與抑菌活性研究

彭湘蓮 付紅軍 劉微微

(中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院1，長沙 410004)(稻谷及副產(chǎn)物深加工國家工程實驗室2，長沙 410004)

山蒼子(Litseacubeba) 別名山雞椒，屬于樟科木姜子屬植物，在我國廣泛種植，主要分布于湖南、湖北、江西、浙江、福建、云南等地[1]。山蒼子油是從山蒼子果實或其他組織中提取出來黃色油狀液體，由于產(chǎn)地地理條件的差異導(dǎo)致其成分會有所不同。山蒼子油中的活性成分主要有檸檬醛、D-檸檬烯、馬鞭烯、芳樟醇、香葉醇、香茅醇等成分，其中抑菌效果較好的為檸檬醛[2]。

研究表明，山蒼子油具有一定的抑菌活性，其對大部分的真菌和細(xì)菌具有一定的抑制或滅殺作用[3-4]。余伯良等[5]采用平板法研究山蒼子油對花生醬的防霉保鮮效果，結(jié)果表明當(dāng)培養(yǎng)基 pH 5.5時，山蒼子油對多數(shù)霉菌的最低抑菌濃度為1.77 mg/mL。李文茹等[6]使用了平板菌落計數(shù)法進(jìn)行山蒼子精油的抑菌實驗，山蒼子精油對黑曲霉和繩狀青霉的最低抑菌濃度分別為0.125%和0.25%，山蒼子精油對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度均為0.125%。吳均等[7]采用抑菌圈實驗對山蒼子油的抑菌活性進(jìn)行測定。5%的山蒼子油在含有金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)基中有抑菌圈生成，而在含有大腸桿菌的培養(yǎng)基中未出現(xiàn)抑菌圈。

目前我國對于山蒼子油的用途主要為食用香料，由于其無毒且有顯著的抑菌效果，使得在食品防腐保鮮領(lǐng)域備受青睞。本實驗選用湘西永順產(chǎn)山蒼子果實，采用水蒸氣蒸餾法[8]提取山蒼子精油，利用氣相色譜-質(zhì)譜法分析山蒼子精油的化學(xué)成分，選取大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白曲霉、青霉4種菌種為代表菌種，通過測定平板菌落計數(shù)、最低抑菌濃度、熱處理影響以及pH值影響來測定山蒼子精油的抑菌活性，為山蒼子精油的開發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑

新鮮山蒼子果實(采自湖南省湘西永順土家族苗族自治州)；結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂、Baird-Parker瓊脂培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基；其他試劑均為分析純。大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白曲霉、青霉(中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院微生物實驗室提供)。

1.1.2 儀器與設(shè)備

Clarcus 600 GC-MS聯(lián)用儀；WK-10B高能性中藥粉碎機(jī)；MJ-54A型高壓蒸汽滅菌鍋；SW-CJ-2F型雙人雙面凈化工作臺。

1.2 實驗方法

1.2.1 水蒸氣蒸餾法提取山蒼子精油

將山蒼子果實陰干后粉碎后過20目篩，密封保存于冰箱備用。稱取50 g粉末樣品置于1 000 mL圓底燒瓶中，并加500 mL蒸餾水，用電熱套進(jìn)行水蒸氣蒸餾提取直至無揮發(fā)油產(chǎn)生，用石油醚收集油層，待石油醚揮發(fā)后稱量。按《中國藥典》2010 版一部附錄 XD 揮發(fā)油測定法測定山蒼子干果中山蒼子精油含量，平行測定 3 次，取平均值，并將山蒼子精油置于冰箱保存，用于后續(xù)GC-MS分析和抑菌活性測定。

1.2.2 山蒼子精油的成分分析(GC-MS)

采用美國Perkin Elmer公司Clarcus 600氣質(zhì)聯(lián)用分析儀。GC條件：色譜柱為Elite-5MS(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；升溫程序: 80 ℃保持3 min，5 ℃/min升溫至100 ℃，保持1 min， 10 ℃/min升溫至130 ℃，保持3 min，20 ℃/min升溫至230 ℃，保持6 min； 載氣為高純氦氣；進(jìn)樣口溫度250 ℃；進(jìn)樣量0.5 μL；分流比50∶1。MS條件：電子轟擊離子源進(jìn)樣方式；電離電壓70 eV；離子源溫度240 ℃；傳輸線溫度280 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z35～500。山蒼子精油的GC-MS定量分析采用峰面積歸一化法，化合物定性采用NIST標(biāo)準(zhǔn)譜庫[9]。

1.2.3 菌種的活化及菌懸液的制備

配制適量培養(yǎng)基，高壓蒸汽滅菌之后倒于無菌培養(yǎng)皿之中，待冷卻凝固后，將大腸桿菌接種在結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂平板上，將金黃色葡萄球菌接種在Baird-Parker瓊脂平板上，34 ℃培養(yǎng) 24 h；將白曲霉、青霉2種霉菌轉(zhuǎn)接到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基斜面中活化，28 ℃培養(yǎng) 48 h。挑取少量菌落于無菌生理鹽水中，細(xì)菌采用平板計數(shù)法，霉菌使用顯微鏡直接記數(shù)法測菌體個數(shù)，將菌懸液濃度調(diào)至 106～107CFU/mL，備用。

1.2.4 平板菌落計數(shù)法

1 mL山蒼子精油加10 mL無菌培養(yǎng)基混勻冷卻，1 mL丙三醇加10 mL無菌培養(yǎng)基作為空白對照；冷卻后取200 μL菌懸液涂布于平板培養(yǎng)基上，按1.2.3的條件進(jìn)行培養(yǎng)，每個菌種做3組平行，觀察菌落生長情況。

1.2.5 最小抑菌濃度的測定

采用二倍稀釋法，配制一系列梯度濃度的山蒼子精油丙三醇溶液，與熔融的培養(yǎng)基混勻，使得培養(yǎng)基中山蒼子精油的濃度分別為30、15、7.5、3.75、1.88、0.94、0.47、0.23、0.11 μL/mL；待培養(yǎng)基凝固后，用移液槍吸取 200 μL菌懸液，均勻涂布于固體培養(yǎng)基表面[7]。以不長菌時的山蒼子精油的體積濃度來確定山蒼子精油抑菌的最低體積濃度為山蒼子精油的MIC值，以丙三醇-無菌水作對照。

1.2.6 熱處理對山蒼子精油抑菌活性的影響

將山蒼子精油分別于40、60、80、100 ℃下熱處理10 min，取出后立刻置于冰浴中冷卻待用；10 mL含1/2 MIC山蒼子精油濃度的無菌培養(yǎng)基冷卻待用；待培養(yǎng)基冷卻后，取200 μL菌懸液均勻涂布在平板上，以等量無菌水涂布作為空白對照，按1.2.3的條件進(jìn)行培養(yǎng)，每個菌種做3組平行取均值。

1.2.7 pH值對山蒼子精油抑菌活性的影響

利用磷酸緩沖液來調(diào)制不同pH值的培養(yǎng)基，pH值梯度濃度分別為3.5、4.5、5.5、6.5、7.5；山蒼子精油與無菌培養(yǎng)基混勻使得培養(yǎng)基中山蒼子精油的濃度為1/2 MIC，冷卻后取200 μL菌懸液均勻涂布在平板上，以等量無菌水涂布作為空白對照，按1.2.3的條件進(jìn)行培養(yǎng)，每個菌種做3組平行取均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 山蒼子精油的含量

按1.2.1進(jìn)行水蒸氣蒸餾測得山蒼子干果粉末中山蒼子精油平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.28%。

2.2 山蒼子精油的主要成分

水蒸氣蒸餾法提取得到的山蒼子精油利用GC-MS法進(jìn)行成分分析，其TIC見圖1，主要化學(xué)成分鑒定出23種物質(zhì)詳見表1，其中檸檬醛的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為74.07%(橙花醛38.57%；香葉醛35.50%)，高于贛南產(chǎn)山蒼子油的68.43%[10]。

圖1 水蒸氣蒸餾法提取的山蒼子精油的TIC

表1 湘西永順產(chǎn)山蒼子精油的化學(xué)成分

序號化合物名稱分子式質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%1α-蒎烯C10H161.152莰烯C10H160.473檜烯C10H160.414β-蒎烯C10H160.8056-甲基-5庚烯-2酮C8H14O1.146β-月桂烯C10H161.517檸檬烯C10H166.528桉樹腦C10H18O1.419芳樟醇C10H18O1.76105-甲基-2-異丙烯基-4-己烯醛C10H16O0.2511香茅醛C10H18O2.2012龍腦C10H18O0.0813α-松油醇C10H18O0.63141,3,4-三甲基-3-環(huán)己烯基1-甲醛C10H16O1.2015橙花醇C10H18O0.7016橙花醛C10H16O38.5717香葉醇C10H18O1.0118香葉醛C10H16O35.50193,7-二甲基-2,3-環(huán)氧基-6-辛烯醇C10H18O20.1820β-欖香烯C15H240.32211-石竹烯C15H241.1522α-丁子香烯C15H240.1823氧化石竹烯C15H24O0.32其他2.54

2.3 平板計數(shù)的結(jié)果與分析

山蒼子精油對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白曲霉和青霉的抑菌活性如表2所示。結(jié)果表明，添加了丙三醇的平板培養(yǎng)基上，4種菌都長出了菌落，且生長情況良好；而添加了山蒼子精油的平板培養(yǎng)基上均未有菌落生長，可見山蒼子精油對4種菌都表現(xiàn)出了有效的抑制作用。

表2 山蒼子精油的抗菌活性

注：“+”表示平板上有菌落生長，“—”表示平板上未長出菌落。

2.4 山蒼子精油最低抑菌濃度的結(jié)果與分析

山蒼子精油對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白曲霉和青霉的最低抑菌濃度(MIC)如表3所示。

山蒼子精油對霉菌抑菌效果優(yōu)于細(xì)菌。山蒼子精油對青霉、白曲霉的最小抑菌濃度(MIC)分別為0.47、0.94 μL/mL，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度(MIC) 分別為1.88、0.94 μL/mL，對細(xì)菌的抑菌結(jié)果與吳均等[7]的實驗結(jié)果有些許差異，可能由于山蒼子精油中檸檬醛含量差異所致。

表3 山蒼子精油對霉菌和細(xì)菌最低抑菌濃度

注：“+”表示平板上有菌落生長，“—”表示平板上未長出菌落。

2.5 熱處理對山蒼子精油抑菌活性的影響

不同溫度熱處理后的山蒼子精油對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白曲霉、青霉4種菌的抑菌活性如表4所示。

表4 不同溫度處理后山蒼子精油對實驗菌種菌落數(shù)的影響/個

從表4可以看出，當(dāng)熱處理溫度在40～60 ℃區(qū)間時，溫度對山蒼子精油抗菌活性影響不大，而熱處理溫度在60～100 ℃區(qū)間時，溫度升高使山蒼子精油中有效抑菌活性物質(zhì)揮發(fā)或發(fā)生裂解，導(dǎo)致山蒼子精油抑菌活性有所下降。

2.6 pH值對山蒼子精油抑菌活性的影響

不同pH值條件下山蒼子精油對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白曲霉、青霉4種菌的抑菌活性如表5所示。

表5 不同pH值條件下山蒼子精油對對實驗菌種菌落數(shù)的影響/個

由表5可知，在pH值為3.5～7.5的條件下，山蒼子精油對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌抑菌活性的影響較大，pH值越小山蒼子精油的抑菌效果越好；但對白曲霉和青霉而言，不同pH值對山蒼子精油的抑菌活性影響不大，可能是霉菌相對于細(xì)菌來說更易在酸性環(huán)境下生存。由此可知當(dāng)pH值在3.5～7.5的范圍內(nèi)， pH值越小山蒼子精油抑菌效果越好，而pH值對山蒼子精油抑霉菌活性影響不大。

3 結(jié)論

本實驗采用水蒸氣蒸餾法對湘西永順產(chǎn)的新鮮山蒼子果實進(jìn)行提取，其山蒼子精油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.28%。利用氣相色譜-質(zhì)譜法分析鑒定出湘西永順產(chǎn)山蒼子精油的主要化學(xué)成分有23種，其中檸檬醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)為74.07%(橙花醛：38.57%；香葉醛：35.50%)。山蒼子精油對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白曲霉、青霉4種菌的最低抑菌濃度(MIC)分別為1.88、0.94、0.94、0.47 μL/mL。山蒼子精油能抑制細(xì)菌和霉菌的生長。當(dāng)熱處理溫度在40～100 ℃區(qū)間時，溫度導(dǎo)致山蒼子精油的抑菌活性有所下降；當(dāng)pH值在3.5～7.5內(nèi)，pH值越小山蒼子精油的抑菌效果越好，而pH值對山蒼子精油抑霉菌活性的影響不大，具體抑菌機(jī)理有待進(jìn)一步探討。