超微粉碎輔助提取黑豆皮水溶性膳食纖維及其特性研究

喬小全 任廣躍 段 續 陳 曦 劉軍雷李葉貝 屈展平 黃 菊

(河南科技大學食品與生物工程學院；食品加工與安全國家實驗教學示范中心，洛陽 471023)

黑大豆,異名烏豆、櫓豆、枝仔豆、冬豆子,為豆科植物大豆[Glycinemax (L.)Merr.]的黑色種子，因其具有較高的營養價值，被賦予“豆中之王”的美譽[1]。黑大豆是傳統的藥食同源農產品，其種皮是優質膳食纖維的理想來源，在改善潤腸通便以及對糖尿病、高血壓、肥胖癥、心血管疾病等慢性非傳染性疾病具有預防和保健作用[2-3]。在黑豆油的生產加工過程中，黑豆皮是主要的廢棄物，含有豐富的纖維素、維生素、多糖等多種營養物質，充分利用黑豆皮制備水溶性膳食纖維，可彌補黑豆皮研究領域空缺，具有一定的市場價值和良好的經濟前景[4]。

膳食纖維根據其水溶性可分成水溶性膳食纖維(Soluble Dietary Fiber，SDF)和非水溶性膳食纖維(Insoluble Dietary Fiber，IDF)兩大類[5]。馮子倩等[6]采用堿性過氧化氫法提升黑豆皮水溶性膳食纖維產率并探究改性后的水溶性膳食纖維具有顯著的膽酸結合能力。羅磊等[7]利用超微粉碎輔助酶法技術在提高綠豆皮水溶性膳食纖維產率的同時改善了其物理特性。劉博等[8]對可溶性膳食纖維的生理功能進行了研究，表明水溶性膳食纖維具有降低血糖、血脂以及預防心血管疾病、預防腫瘤發生等多種生理功能；羅磊等[9]發現了綠豆皮水溶性膳食纖維具有提高機體清除自由基的能力。迄今為止，國內外主要利用綠豆皮、癩葡萄渣、梨渣、椪柑渣、蘆筍、米糠[9-14]等原料制備水溶性膳食纖維。近年來，國內外主要集中于對黑豆皮色素的提取及相關性質研究，但關于以黑豆皮為原料，采用超微粉碎輔助酶水解技術制備水溶性膳食纖維鮮見報道。

超微粉碎技術具有使粉體顆粒微細化，孔隙率和比表面積增加的功能，可顯著提高膳食纖維的物化特性且對操作設備、工藝要求不高，成本相對較低[15]。酶水解技術具有降解細胞壁，有效減小提取阻力，進而提高提取效率，縮短提取時間。此外，酶水解技術還具有操作簡單、條件溫和、產品純度高等優點。本實驗擬采用超微粉碎輔助酶水解技術提取黑豆皮水溶性膳食纖維，以提高水溶性膳食纖維的產率，并對其特性進行研究，為開發具有降血脂功效的食品添加劑提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑豆皮：蘇州市天靈中藥飲片有限公司；木瓜蛋白酶：10 U/mg、纖維素酶：50 U/mg，上海源葉生物科技有限公司；α-淀粉酶：37 U/mg，北京奧博星生物技術有限責任公司；膽酸鈉：分析純，上海翊圣生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)：分析純，上海如吉生物科技發展有限公司；抗壞血酸(Vc)、濃硫酸、醋酸、醋酸鈉、糠醛、三乙酸、硫酸亞鐵、磷酸二氫鈉、氯化鐵、磷酸氫二鈉、鐵氰化鉀、水楊酸、過氧化氫、無水乙醇等：均為分析純。

1.2 儀器與設備

HMB-701型超微粉碎機：北京環亞天元機械技術有限公司；HC-200型高速多功能粉碎機：浙江省永康市金穗機械制造廠；RE52-3型旋轉蒸發器：上海滬西分析儀器有限公司；UV759型紫外可見分光光度計：上海精密科學儀器有限公司；7GL-20M型臺式高速冷凍離心機：湖南湘儀實驗儀器開發有限公司；SHB-3型循環水式多用真空泵：鄭州長城科工貿有限公司；PHS-25型pH計：上海雷磁儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程 1.3.1.1 黑豆皮粉樣品制備

黑豆皮→清洗→干燥→粉碎→過40目篩→黑豆皮粗粉→酶解、滅酶→干燥→黑豆皮粉樣品

1.3.1.2 黑豆皮水溶性膳食纖維的提取

黑豆皮粉樣品→纖維素酶降解→離心→濃縮→無水乙醇沉淀→離心、分離→干燥→黑豆皮SDF

1.3.2 操作要點

經高速多功能粉碎機過40目篩制備黑豆皮粗粉，向其添加37 U/mg，ɑ-淀粉酶50 μL/g，在65 ℃水浴恒溫振蕩器中搖蕩1 h，滅酶10 min，冷卻，再向其添加10 U/mg木瓜蛋白酶100 μL/g[16]，在45 ℃水浴恒溫振蕩器中搖蕩2 h[17]，滅酶10 min，經過濾、烘干至恒重，制備黑豆皮粉樣品。

將準確稱量的黑豆皮粉樣品置于100 mL離心管中，醋酸-醋酸鈉緩沖溶液溶解纖維素酶后，在離心管中與樣品充分混合并振蕩，水浴溫度60 ℃條件下提取60 min，沸水浴滅酶10 min并冷卻后，于離心機4 000 r/min離心15 min，濾去殘渣，取其上清液進行濃縮。之后，用4倍體積的無水乙醇對濃縮液沉淀2 h，離心取沉淀，干燥至恒重，即為黑豆皮水溶性膳食纖維(SDF)。

1.3.3 超微粉碎對提取黑豆皮水溶性膳食纖維的影響

準確稱量黑豆皮粗粉置于超微粉碎機中粉碎，制備黑豆皮超微粉，將一次性所制得的超微粉分別過50、100、200、300、400、500目篩，獲得不同粒度的超微粉，按照1.3.1.2工藝流程制備黑豆皮水溶性膳食纖維，研究超微粉粒徑大小對產率的影響，并在此基礎，進一步優化酶法提取黑豆皮水溶性膳食纖維的工藝。

1.3.4 單因素實驗

通過預實驗，預測較好的參數范圍并實施單因素實驗，均實施3次平行實驗[18]。

(1)液固比：固定酶解溫度、酶解時間、酶底比分別為55 ℃、2 h、0.2(U/mg)，考察液固比[10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1(mL/g)]對黑豆皮水溶性膳食纖維產率的影響。

(2)酶底比：固定酶解溫度、酶解時間、液固比分別為55 ℃、2 h、30∶1(mL/g)，考察酶底比[0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35(U/mg)]對黑豆皮水溶性膳食纖維產率的影響。

(3)酶解時間：固定酶解溫度、酶底比、液固比分別為55 ℃、0.2(U/mg)、30∶1(mL/g)，考察酶解時間(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h)對黑豆皮水溶性膳食纖維產率的影響。

(4)酶解溫度：固定酶解時間、酶底比、液固比分別為2 h、0.2(U/mg)、30∶1(mL/g)，考察酶解溫度(40、45、50、55、60、65 ℃)對黑豆皮水溶性膳食纖維產率的影響。

1.3.5 正交實驗設計

在單因素實驗的基礎上，選擇對黑豆皮水溶性膳食纖維產率影響相對較大的因素為考察因素，以黑豆皮SDF產率為考察指標，采用Design-Expert 8.05進行處理與分析，得出黑豆皮SDF提取的最佳工藝條件。

1.4 測定指標與方法

1.4.1 黑豆皮SDF產率的計算

將收集到的固體物質置于45 ℃電熱鼓風干燥箱中干燥1～2 h，蓋好蓋子取出，在干燥器內冷卻0.5 h后稱量。重復操作，直至前后2次的質量差<2 mg，即為恒重，按式(1)計算黑豆皮SDF的產率。

(1)

式中：X為黑豆皮SDF產率/%；m1為黑豆皮水溶性膳食纖維的提取質量/g；m2為黑豆皮粉樣品的質量/g。

1.4.2 膨脹性的測定

準確稱量1.0 g黑豆皮SDF粉末(m3)于干燥的50 mL量筒中，記錄其初始體積V1，然后添加蒸餾水至刻度，攪拌均勻后于室溫靜置過夜，觀察并記錄吸水后體積V2，按式(2)計算黑豆皮SDF的膨脹性[19]。

(2)

式中：SWC為黑豆皮SDF膨脹性/mL/g；V1為初始體積/mL；V2為吸水膨脹后的體積/mL；m3為試樣質量/g。

1.4.3 持水性的測定

準確稱量0.5 g黑豆皮SDF粉末(m4)置于50 mL離心管中，向其添加20 mL蒸餾水，室溫下漩渦振蕩24 h，3 000 r/min離心15 min，除去上清液并用濾紙吸干殘留水分稱量后計算為濕重M，按式(3)計算黑豆皮SDF的持水性[20]。

(3)

式中：WHC為黑豆皮SDF持水性/g/g；m4為試樣質量/g；M為濕重/g。

1.4.4 持油性的測定

準確稱量0.5 g黑豆皮SDF粉末(m5)置于經干燥的50 mL離心管中，向其添加10 mL菜籽油，搖勻浸泡1 h，間隔10 min搖蕩一次，在3 000 r/min離心15 min，除去上清液并用濾紙吸干殘留油分，稱量剩余沉淀重量m6，按式(4)計算黑豆皮SDF的持油性[21]。

(4)

式中：OHC為黑豆皮SDF持油性/%；m5為黑豆皮SDF粉末質量/g；m6為剩余殘渣質量/g。

1.4.5 黑豆皮SDF對膽酸鈉的體外吸附測定

測定方法參照文獻[22]。

1.5 數據處理

數據均用Origin 8.5與Design-Expert 8.05進行處理與分析。

2 結果與分析

2.1 超微粉碎粒徑大小對黑豆皮SDF產率的影響

由圖1可知，在過50～400目篩(粒徑270～25 μm)時，黑豆皮SDF產率隨篩網目數的增大而升高。當實驗樣品過400目篩網而未過500目(粒徑25～38 μm)時，黑豆皮SDF產率達12.28%。可能由于經超微粉碎后，顆粒微細化，粉體比表面積增大，進而增大了與溶劑的接觸面積[23]，促使黑豆皮SDF的進一步溶出；此外，黑豆皮細胞在強作用力下破碎更加徹底，促使進一步降解細胞壁，增強其親水性，使黑豆皮SDF可直接溶于溶劑中，不用間接通過細胞膜而緩慢擴散。實驗樣品過500目篩網(粒徑<25 μm)，提取率為12.31%，與過400目篩網相比，產率變化較小，可能由于粒徑小的超微粉，增大粉體內部靜電摩擦力，減弱其流動性，加強其吸附作用，粉體間易出現黏附和結團現象。綜合考慮，選取過400目而未過500目(粒徑25～38 μm)的樣品開展纖維素酶酶解探究。

圖1 不同超微粉粒徑對黑豆皮SDF產率的影響

2.2 單因素實驗結果

由圖2可知，當液固比在[10∶1～30∶1(mL/g)]時，黑豆皮SDF產率隨液固比的升高而呈現增加的趨勢。推測可能是液固比例越大，使粉體顆粒與溶劑接觸更加充分，有助于黑豆皮SDF的溶出；提取液中黑豆皮SDF質量濃度越低，體系中傳質推動力就越大，進而提升了提取速率。當液固比大于30∶1(mL/g)時，黑豆皮SDF產率隨液固比增大而呈現平緩趨勢；另外，過高的液固比不僅造成原料的浪費，還會增加后期處理的難度。綜合考慮，選取30∶1(mL/g)為適宜液固比。

圖2 四因素對黑豆皮SDF產率的影響

由圖2可知，當酶底比在0.10～0.20(U/mg)時，黑豆皮SDF產率隨纖維素酶添加量的增加而增大，當酶底比大于0.20(U/mg)時，黑豆皮SDF產率呈現下降趨勢。可能是由于適量纖維素酶作用下，促使黑豆皮SDF不斷溶出；與此同時，部分水不溶性膳食纖維發生降解，分子鏈斷裂，分子量降低，有助于水不溶性膳食纖維(IDF)轉變為水溶性膳食纖維(SDF)；而纖維素酶添加量過多，能促使水不溶性膳食纖維降解為較低分子量的低聚糖、多糖等，因其分子量過小而不能被乙醇沉淀，進而降低黑豆皮SDF產率。綜合分析，選取0.20 U/mg為適宜的酶底比。

由圖2可知，當酶解時間在1～2 h時，隨酶解時間推移，黑豆皮SDF產率呈增加的趨勢；當酶解時間大于2 h時，SDF產率呈下降的趨勢。可能由于在纖維素酶作用下，充分水解，進而提高了黑豆皮SDF產率；但隨著酶解時間的推移，纖維素酶作用有限，提取量接近飽和；另外，酶解時間越長，SDF所含果膠、部分半纖維素等物質易發生降解現象[24]。綜合考慮，選取2 h為適宜的酶解時間。

由圖2可知，黑豆皮SDF產率隨酶解溫度的升高而呈先上升后下降的趨勢，在55 ℃時，產率達最大值。由于酶活性受溫度影響很大，過低溫度能減弱酶促反應，而升高溫度可提高酶促反應速度。在55 ℃時，纖維素酶活性最強，酶促反應速度最大。過高的酶解溫度不僅降低酶的活性，還會增大原料提取液黏度，進而降低黑豆皮SDF產率。綜合考慮，選取55 ℃為適宜的酶解溫度。

2.3 響應面實驗結果

2.3.1 響應面法優化SDF提取條件的實驗設計

在單因素實驗結果基礎上，以液固比(X1)、酶底比(X2)、酶解溫度(X3)為實驗因素，以黑豆皮SDF產率(Y)為考察指標，設計三因素五水平的二次通用旋轉組合實驗，對黑豆皮SDF的提取工藝進行優化，實驗因子及其水平見表1。

表1 三元二次通用旋轉組合設計實驗因素水平編碼表

2.3.2 響應面實驗設計與實驗結果

綜合分析各實驗因素對黑豆皮SDF產率的影響，以產率為主要指標，采用二次通用旋轉組合實驗設計，進行響應面分析。其實驗組合及結果見表2。

表2 三元二次通用旋轉組合設計實驗結果

經回歸擬合后，得到二次多項式回歸方程為：

Y=12.01+1.32X1+1.60X2-0.83X3-0.97X1X2-0.43X1X3-0.54X2X3-0.56X21-1.22X22-0.93X23

(5)

2.3.3 黑豆皮SDF產率方差分析表及響應曲面分析

由表3可知，二次回歸模型(P=0.000 1<0.01)影響顯著，且失擬項(P=0.891 4>0.05)影響不顯著，回歸系數R2=0.928 0，表明該回歸模型與實際測量值擬合效果良好，可使用多項回歸方程代替實驗點對實驗結果進行分析。一次項X1、X2、X3，二次項X22、X23對實驗結果影響特別顯著，二次項X21與交互項X1X2對實驗結果影響顯著，交互項X1X3、X2X3對實驗結果的影響均為不顯著。綜合考慮，酶底比、液固比、酶解溫度對實驗結果的影響均顯著，3個因素對實驗結果影響的主次依次為酶底比>液固比>酶解溫度。

表3 黑豆皮SDF產率方差分析表

2.3.4 優化與驗證

根據優化結果可知，黑豆皮SDF提取最優工藝條件：液固比30.41∶1(mL/g)、酶底比187.81(U/mg)、溫度60.46 ℃，產率為12.98%。考慮實際操作的可行性，將最優的黑豆皮SDF提取條件修改為：液固比30∶1(mL/g)、酶底比188(U/mg)、溫度60 ℃，根據修正的最佳提取條件，實施3次重復驗證實驗，得到黑豆皮SDF平均產率為12.01%，與理論值之差<5%，表明所得模型參數準確可靠。

2.4 持水力、持油力和膨脹力的測定

由表4可知，黑豆皮SDF的膨脹力、持水力、持油力分別為：2.56(mL/g)、377%、138%。李夢琴等[25]采用超高壓處理小麥麩皮并提取水溶性膳食纖維(SDF)，測其膨脹力、持水力分別為1.49(mL/g)、308%；鞠健等[26]以山藥皮為原料制備水溶性膳食纖維(SDF)，測其持油性為1.30(g/g)，表明本實驗制備的黑豆皮SDF具備良好的膨脹力、持水力和持油力。具有較高的持水力、持油力、膨脹力的水溶性膳食纖維可使人產生一定的飽腹感，降低食欲，進一步控制肥胖，同時可刺激腸道蠕動，能及時將糞便中的有害物質排出體外，進而降低腸道癌、痔瘡等患病風險。因此，黑豆皮SDF可在食品加工中用作食品添加劑。

表4 黑豆皮SDF膨脹力、持水力和持油力的測定

2.5 膽酸鈉的體外吸附分析

膳食纖維的降血脂功效可用其對膽酸鈉的吸附能力進行衡量，膽固醇分解產物含膽酸鹽，通過借助疏水相互作用、范德華力及氫鍵等與膽酸鹽發生相互作用，或以一種作用力為主，束縛體內膽酸鹽及促使排出體外，使其在腸肝循環過程中降低體內膽酸鹽的積累量，膽固醇代謝得以改善，進而可降低體內膽固醇含量，間接發揮降血脂的功能特性[27]。由圖3可知，SDF溶液中膽酸鈉的濃度在伴隨時間的延長而降低，在最開始的30 min內，濃度變化比較顯著，而后趨于平緩，并趨向一個定值。可能是由于SDF含量有限，其對膽酸鈉的吸附量伴隨時間的延長，逐漸達到飽和狀態，在105 min時，測其膽酸鈉質量濃度1.402 2 g/L，清除量0.597 8 g/L，計算黑豆皮SDF對膽酸鈉吸附率為29.89%。

圖3 膽酸鈉隨時間變化的吸光度值

3 結論

利用超微粉碎輔助酶水解技術提取黑豆皮水溶性膳食纖維，并采用二次通用旋轉組合設計優化提取條件，各因素對產率的影響為：酶底比>液固比>酶解溫度。制備黑豆皮SDF最優工藝為：物料粒徑25～38 μm、液固比30∶1(mL/g)、酶底比188(U/mg)、溫度60 ℃、酶解2 h。該條件下，SDF平均產率為12.01%，膨脹力2.56(mL/g)，持水力377%，持油力138%，對膽酸鈉的吸附率達29.89%，具備一定的降血脂功效，但對制備的黑豆皮SDF分離純化及其生理功能還需進一步的研究。