食用植物油中3-MCPD酯GC-MS測(cè)定方法研究

王永瑞 王 丹 徐宇麗 魏長(zhǎng)慶

(石河子大學(xué)食品學(xué)院1，石河子 832000)(新疆植物藥資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2，石河子 832000)(石河子出入境檢驗(yàn)檢疫局3，石河子 832000)

新疆占中國(guó)1/6左右國(guó)土面積，地大物博，特產(chǎn)豐富，瓜果類農(nóng)產(chǎn)品更是享譽(yù)國(guó)內(nèi)外。近年來，利用新疆特有瓜果籽仁為原料生產(chǎn)的特種油脂不斷深入市場(chǎng)，并贏得廣大人民群眾的好評(píng)[1]。目前，新疆市場(chǎng)銷售的特種油脂有：紅花籽油、葡萄籽油、番茄籽油等多個(gè)種類。在植物油脂中，不同種類的脂肪酸、維生素以及不同的天然色素和微量元素對(duì)人體起著重要的作用，特種油脂因其脂肪酸組成的特殊性對(duì)各種類型體質(zhì)的人群起到不同的保健效果，越來越受到廣大消費(fèi)者青睞[2]。然而近年來研究發(fā)現(xiàn)，在各類食用油以及油類食品中存在著一種潛在的致癌物質(zhì)—氯丙醇酯，這使得食用油的安全問題更加引人關(guān)注。

3-MCPD酯是4類氯丙醇酯中的1類，最早發(fā)現(xiàn)于1980年，由Velí?ek等[3]在用酸水解蔬菜蛋白過程中發(fā)現(xiàn)。隨著檢測(cè)設(shè)備以及檢測(cè)方法的發(fā)展，陸續(xù)有研究者在各類食品中檢測(cè)出3-MCPD酯的存在，如餅干、咖啡、薯?xiàng)l、魚油、食用油、嬰幼兒奶粉等中都有存在[4-9]。3-MCPD酯之所以備受關(guān)注，不僅僅是因?yàn)槠渥鳛橐环N非營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的存在，而是因?yàn)槠溥M(jìn)入人體后會(huì)被水解為游離的3-MCPD。這種物質(zhì)已知具有腎臟毒性，致癌性以及致突變等危害，世界各國(guó)對(duì)3-MCPD都有相應(yīng)的限量標(biāo)準(zhǔn)[10-11]。2017年9月，隨著新的國(guó)家食品安全標(biāo)準(zhǔn)GB 2762—2017《食品中污染物痕量》的正式實(shí)施，關(guān)于調(diào)味品中3-MCPD限量指標(biāo)也有著明確的規(guī)定。因此，本研究采用間接法將油樣中的3-MCPD酯經(jīng)過甲醇鈉-甲醇?jí)A水解為3-MCPD，再固相萃取柱凈化，七氟丁酰咪唑(HFBI)衍生結(jié)合GC-MS方法進(jìn)行檢測(cè)。利用該方法測(cè)定了新疆幾種市售的常見食用植物油和幾種特種食用植物油中3-MCPD酯的含量，評(píng)估新疆市售食用植物油中3-MCPD酯的風(fēng)險(xiǎn)水平的同時(shí)也為食用植物油中3-MCPD酯變化規(guī)律的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

亞麻籽油、紅花籽油、核桃油、花生油、番茄籽油、葡萄籽油、核桃油、菜籽油： (均為一級(jí)油，生產(chǎn)地均為新疆)；3-MCPD標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.6%)；氘代同位素d5-3-MCPD標(biāo)準(zhǔn)品(純度98.5%)；3-MCPD 棕 櫚 酸 二 酯標(biāo)準(zhǔn)品 ( 98%)，d5-3-MCPD 棕櫚酸二酯標(biāo)準(zhǔn)品(純度97%)；N-七氟丁酰基咪唑(98%)；甲基叔丁基醚、無水硫酸鈉、冰醋酸：分析純；甲醇鈉：化學(xué)純；乙酸乙酯、甲醇、正己烷：色譜純。

7890A-5975C氣質(zhì)聯(lián)用儀；85-2 恒溫磁力攪拌器；EL204 電子天平；Xcelvap 全自動(dòng)氮吹濃縮儀；Milli-Q 去離子水發(fā)生器；CleanertMCPD 氯丙醇專用固相萃取柱。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取 3-MCPD、d5-3-MCPD、3-MCPD 棕櫚酸二酯、d5-3-MCPD 棕櫚酸二酯各 10.0 mg (精確至 0.1 mg)，分別置于4支10 mL棕色容量瓶中，加入乙酸乙酯配制成質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)液，于-20 ℃冰箱內(nèi)冷藏儲(chǔ)存。分別將單標(biāo)儲(chǔ)備液用乙酸乙酯稀釋至 100 mg/L，作為標(biāo)準(zhǔn)中間液。使用時(shí)用正己烷逐級(jí)稀釋100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)中間液至所需濃度。

1.3 樣品前處理

1.3.1 水解與凈化

水解：準(zhǔn)確稱取0.10 g油樣至12 mL具蓋玻璃試管中，加入50 μL 10 mg/L的d5-3-MCPD 棕櫚酸二酯內(nèi)標(biāo)溶液(相當(dāng)于 100 ng 游離態(tài)的 d5-3-MCPD)，加入0.5 mL甲基叔丁基醚-乙酸乙酯(8∶2)混合液后，45 ℃下超聲混勻。加入0.5 mL 甲醇鈉-甲醇(0.5 mol/L)室溫下水解4 min后，迅速加入3.0 mL冰乙酸溶液(1.0 mL冰乙酸溶于30 mL 20% NaCl溶液中)，充分渦旋混勻。加入3.0 mL正己烷脫上層油相，渦旋靜置。待明顯分層后，去除正己烷層，該步驟重復(fù)3次。

凈化：將下層水相溶液上樣于 CleanertMCPD 固相萃取柱中，待液體完全進(jìn)入硅藻土填料后，靜置平衡 10 min。再用 15 mL 乙酸乙酯-正己烷體系(體積比為11∶9)洗脫3-MCPD組分，將洗脫液接收于具蓋玻璃管中，于40 ℃水浴下氮吹濃縮至近干，用2 mL異辛烷溶解殘?jiān)?/p>

衍生化：向凈化后的溶液中加入 50 μL HFBI衍生試劑，旋緊蓋子并渦旋混勻，置于 70 ℃恒溫干燥箱中反應(yīng) 20 min。衍生化完成后，取出冷卻至室溫，加 3 mL 水并渦旋振蕩 30 s后靜置分層，棄去下層水相，重復(fù)水洗 3 次后取上層有機(jī)相，經(jīng)無水硫酸鈉除水后裝入進(jìn)樣瓶中，待GC-MS分析。

1.3.2 GC-MS檢測(cè)

色譜條件：DB-5MS毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度280 ℃；柱始溫80 ℃ ，保持1 min，再以10 ℃/min升溫至190 ℃，以40 ℃/min升至300 ℃，保持5 min；載氣：高純氮，流速3.0mL/min；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣體積：1 μL。

質(zhì)譜條件：EI+，電子倍增器增益：+250 V，燈絲電流：100 μA；阱溫度：230 ℃；傳輸線溫度：250 ℃；歧盒溫度：50 ℃；溶劑延遲：3 min；質(zhì)譜采集時(shí)間：3～20 min；掃描質(zhì)量范圍：m/z90～300; 掃描速率：0.65 s/次。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品制備條件的優(yōu)化

水解步驟主體參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.191—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氯丙醇及其脂肪酸酯含量的測(cè)定》，但在以下3個(gè)方面進(jìn)行調(diào)整：(1)使用冰乙酸與20%氯化鈉混合溶液(體積比1∶30)中和溶液中過量的甲醇-甲醇鈉溶液。一方面降低因先加冰乙酸再加氯化鈉溶液復(fù)雜操作引起的誤差；另一方面3-MCPD酯的甲醇/甲醇鈉溶液水解是一個(gè)快速的過程，加入乙酸與20%氯化鈉混合溶液可以快速終止反應(yīng)，避免堿過量造成的3-MCPD分解。(2)洗脫時(shí)，采用乙酸乙酯-正己烷體系(體積比為11∶9)作為洗脫液。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在乙酸乙酯中添加一定比例的正己烷能使之更好地匹配3-MCPD的極性，以減少非目標(biāo)物質(zhì)的干擾。試驗(yàn)結(jié)果表明乙酸乙酯-正己烷體積比為11∶9 時(shí)的回收率最高。(3)復(fù)溶時(shí)，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中使用的溶液是正己烷，但正己烷在70 ℃高溫的衍生化步驟中極易揮發(fā)，導(dǎo)致定容體積不準(zhǔn)，因此改用揮發(fā)性較弱的異辛烷進(jìn)行復(fù)溶。

2.2 3-MCPD和d5-3-MCPD的HFBI衍生物的定性分析

采用間接法檢測(cè)分析3-MCPD酯，最終是通過將3-MCPD酯堿水解成3-MCPD后，再經(jīng)過HFBI衍生化進(jìn)行GC-MS檢測(cè)分析。在3-MCPD衍生物的質(zhì)譜圖中(圖1)，m/z169 [C3F7]-、197[C3F7CO]-、225[C3F7CO2C]-離子碎片的相對(duì)豐度較大，但其均為七氟丁酰基的特征離子，并不是3-MCPD衍生物的特征離子。本文采用代表性的3-MCPD衍生物的特征離子作為定性、定量離子，如

圖1 3-MCPD衍生物的質(zhì)譜圖

表1所示。其中，m/z=253是3-MCPD的HFBI衍生物[M-C3F7CO2-HCl]+碎片離子的質(zhì)荷比，m/z277(275)是[M-C3F7CO2CH2]+碎片離子的質(zhì)荷比，m/z289(291)是[M-C3F7CO2]+的碎片離子質(zhì)荷比，m/z453是[M-CH2Cl]+碎片離子的質(zhì)荷比。相應(yīng)的d5-3-MCPD的衍生物的對(duì)應(yīng)離子碎片質(zhì)荷比為m/z=257、278(280)、294(291)、456[12]。

表1 3-氯丙醇及其內(nèi)標(biāo)物衍生產(chǎn)物的特征離子

注：下劃線離子為定量離子，其余為定性離子。

2.3 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.3.1 線性范圍、檢出限、定量限

準(zhǔn)確移取一定量的3-MCPD以及d5-3-MCPD標(biāo)準(zhǔn)溶液于具蓋試管中，用正己烷定容至2 mL，配制成相當(dāng)于樣品中3-MCPD含量為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L的一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。利用梯度濃度的3-MCPD標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果如圖2所示。以3-MCPD以及d5-3-MCPD衍生物的定量離子峰面積之比為縱坐標(biāo)，3-MCPD質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。得到的線性方程為Y=0.289 9X+0.045 2，R2=0.988 5。以信噪比(S/N)為3和10時(shí)對(duì)應(yīng)的加標(biāo)水平分別作為方法的檢測(cè)限和定量限。此方法在0.5～2.5 mg/L范圍內(nèi)線性相關(guān)性良好，檢出限為0.025 5 mg/kg，定量限為0.093 3 mg/kg。滿足油脂中3-MCPD酯的分析檢測(cè)。

圖2 3-MCPD標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3.2 加標(biāo)回收率

取15份胡麻油樣品，其中3份空白對(duì)照，其余樣品中分別加入0.50、1.00、2.00、2.50 mg/kg 3-MCPD棕櫚酸二酯標(biāo)準(zhǔn)液，每組做3個(gè)平行樣，經(jīng)過樣品前處理后檢測(cè)3-MCPD酯含量，計(jì)算相應(yīng)的加標(biāo)回收率和RSD，如表2所示。結(jié)果表明3-MCPD

表2 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)(n=3)

脂肪酸酯的平均加標(biāo)回收率在94.80%～104.62%之間，RSD 1.47%～5.23%。表明本研究所建立的方法的準(zhǔn)確度和精密度較高，適用于食用植物油中3-MCPD酯含量的測(cè)定。

2.3.3 儀器精密度

選取3個(gè)濃度分別為0.50、1.00、2.00 mg/kg的3-MCPD標(biāo)品衍生后進(jìn)行GC-MS檢測(cè)，平行進(jìn)樣3次，計(jì)算測(cè)定值的RSD。結(jié)果如表3所示，3個(gè)濃度的3-MCPD標(biāo)品的RSD值在1.83%～3.51%，表明儀器的性能良好，可以進(jìn)行相關(guān)的實(shí)驗(yàn)。

表3 儀器精密度(n=3)

2.4 新疆幾種市售食用植物油中3-MCPD酯的含量

檢測(cè)新疆產(chǎn)的幾種市售食用植物油，每種油脂做3個(gè)平行樣。結(jié)果取平均值如表4所示。

表4 新疆幾種食用植物油中3-MCPD酯的測(cè)定結(jié)果

由表4可以看出，新疆市售的幾種食用植物油中均檢測(cè)出濃度不等的3-MCPD酯。在新的國(guó)家食品安全標(biāo)準(zhǔn)GB 2762—2017《食品中污染物痕量》中對(duì)于液態(tài)調(diào)味品中3-MCPD的限量為0.4 mg/kg，固態(tài)調(diào)味品中3-MCPD的限量為1.0 mg/kg。借此標(biāo)準(zhǔn)，可以看到在新疆的幾種食用植物油中，菜籽油、亞麻籽油、番茄籽油、花生油以及葡萄籽油受3-MCPD酯的污染較嚴(yán)重，含量都高于0.4 mg/kg。其中葡萄籽油、菜籽油中3-MCPD酯的含量在1.0 mg/kg以上。而核桃油、大豆油、紅花籽油中3-MCPD酯的含量都低于0.4 mg/kg。

造成食用植物油中3-MCPD酯的含量的差別一方面原因與其自身的組成成分有關(guān)。不同的食用植物油中所含有的3-MCPD酯的前體物質(zhì)如三酰基甘油酯、氯離子、脂肪酸等存在著差異性[13]。另一方面與油脂的精煉工藝的差異有關(guān)。食用植物油的精煉過程的四個(gè)主要步驟：脫膠、脫酸、脫色和脫臭。在精煉的時(shí)候，若采用磷酸進(jìn)行脫膠，可能會(huì)增加食用植物油中氯離子的含量，導(dǎo)致3-MCPD酯含量的增加；脫色白土的種類和酸性強(qiáng)弱也會(huì)影響食用植物油中3-MCPD的生成。目前已初步證實(shí)，精煉過程中的脫臭工序是3-MCPD酯生成的主要環(huán)節(jié)[14]。脫臭工序是在高溫加熱條件下去除不需要的低沸點(diǎn)組分。在這過程中，植物油中的氯離子與酰基甘油酯等 3-MCPD酯的前體物質(zhì)通過SN1取代反應(yīng)生成 3-MCPD 酯。因此，在脫臭工序前盡可能除去3-MCPD酯的前體物質(zhì)可以有效的預(yù)防3-MCPD酯的生成[15-16]。或者通過適當(dāng)?shù)恼{(diào)整脫臭工序，比如采取分步脫臭。第一步進(jìn)行低溫長(zhǎng)時(shí)間水蒸氣蒸餾去除大部分不需要的易揮發(fā)組分，第二步高溫短時(shí)間水蒸氣蒸餾去除剩余少量高沸點(diǎn)組分。縮短高溫加熱時(shí)間，也可以有效的降低油脂中3-MCPD酯的形成。

3 結(jié)論

3.1 本實(shí)驗(yàn)通過甲醇鈉-甲醇?jí)A水解，固相萃取柱凈化，HFBI衍生結(jié)合GC-MS方法測(cè)定食用植物油中3-MCPD酯含量。該方法在0.50～2.50 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，檢出限為0.025 5 mg/kg，定量限為0.093 3 mg/kg。3-MCPD酯的平均加標(biāo)回收率在94.80%～104.62%之間，RSD 1.47%～5.23%。本方法靈敏度高重復(fù)性好，能夠很好的適用于食用植物油中3-MCPD酯的檢測(cè)。

3.2 采用了該方法測(cè)定的新疆幾種市售食用植物油中的中3-MCPD酯的含量。在新疆市售的幾種食用植物油中均檢測(cè)出濃度不等的3-MCPD酯。其中菜籽油、亞麻籽油、番茄籽油、花生油以及葡萄籽油受3-MCPD酯的污染較嚴(yán)重，3-MCPD酯的含量都高于0.4 mg/kg。而核桃油、大豆油、紅花籽油中3-MCPD酯的含量都低于0.4 mg/kg，達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)。