金梅清暑顆粒的定性定量方法研究

徐向平，胡展晴，葉惠煊，劉淑妦，張振賢，黃 勝*

(1.九芝堂股份有限公司，長(zhǎng)沙 410021；2.中南大學(xué)湘雅藥學(xué)院，長(zhǎng)沙 410013)

金梅清暑顆粒現(xiàn)收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第十四冊(cè)，是九芝堂股份有限公司的獨(dú)家生產(chǎn)品種，標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)為WS3-B-2725-97-2014Z。其處方由金銀花、烏梅、淡竹葉和甘草4味中藥組成，具有清暑解毒和生津止渴的功效，臨床上常用于治療夏季暑熱、口渴多汗、頭昏心煩和小便短赤，并防治沙痱和暑癥[1-2]。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Waters 2695-2998高效液相色譜儀(美國(guó)沃特世公司)；DZKW型電熱恒溫水浴鍋(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)；KQ-300DV型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；AY220型電子分析天平(日本島津公司)；CP225D型電子分析天平(德國(guó)賽多利斯公司)；Merck硅膠G薄層層析板(德國(guó)默克公司)。

1.2試藥 山銀花對(duì)照藥材(批號(hào)121595-201202)，灰氈毛忍冬皂苷乙(批號(hào)111814-201303)和綠原酸(批號(hào)110753-201415)，均為中國(guó)食品藥品檢定研究院生產(chǎn)；金梅清暑顆粒(九芝堂股份有限公司生產(chǎn)，規(guī)格：15 g·袋-1)；乙腈為色譜純；水為超純水；其他試劑均為分析純。本實(shí)驗(yàn)樣品所涉及的藥材均由九芝堂股份有限公司質(zhì)量中心按照《中國(guó)藥典》2015年版一部相應(yīng)品種項(xiàng)下的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)合格后使用。

2 方法與結(jié)果

2.1山銀花TLC鑒別

2.1.1色譜條件 采用硅膠G薄層板，以三氯甲烷-甲醇-水(6∶4∶1)10 ℃下放置的混合溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的硫酸乙醇溶液，在105 ℃下加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。

2.1.2對(duì)照品溶液的制備 取灰氈毛忍冬皂苷乙對(duì)照品適量，加體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇使溶解，搖勻，制成質(zhì)量濃度為0.6 mg·mL-1的對(duì)照品溶液。

2.1.3對(duì)照藥材溶液的制備 精密稱(chēng)取山銀花對(duì)照藥材1 g，加入40 mL乙醚使溶解，超聲處理15 min，濾過(guò)，濾渣揮干殘留的乙醚后，加甲醇30 mL繼續(xù)超聲處理20 min，濾過(guò)，水浴蒸干濾液，殘?jiān)蛹兓?0 mL使溶解，再用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，加純化水洗滌2次，每次20 mL，正丁醇液回收溶劑至近干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為對(duì)照藥材溶液[3]。

2.1.4供試品溶液的制備 稱(chēng)取金梅清暑顆粒10 g，研細(xì)，按照2.1.3項(xiàng)下方法制成供試品溶液。

2.1.5陰性對(duì)照溶液的制備 取處方中除去山銀花的全部藥味，按照處方比例制成缺山銀花的陰性對(duì)照樣品。稱(chēng)取陰性對(duì)照樣品10 g，研細(xì)，按照2.1.3項(xiàng)下方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.1.6實(shí)驗(yàn)結(jié)果 取連續(xù)生產(chǎn)的3批樣品(批號(hào)：20160301，20160302和20160303)，按照2.1.4項(xiàng)下方法分別制成相應(yīng)的供試品溶液。按照TLC法(《中國(guó)藥典》2015年版四部通則0502)實(shí)驗(yàn)，吸取對(duì)照品溶液和對(duì)照藥材溶液各5 μL、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各10 μL，按照2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行TLC法實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，在供試品色譜中，與對(duì)照藥材和對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，而陰性對(duì)照色譜中則未見(jiàn)明顯干擾，表明該方法專(zhuān)屬性良好，見(jiàn)圖1。

圖1TLC鑒別

1.灰氈毛忍冬皂苷乙對(duì)照品；2.山銀花對(duì)照藥材；3.陰性對(duì)照；4～6.金梅清暑顆粒樣品。

Fig.1 TLC chromatogram

1.macranthoidin B reference substance；2.LoniceraeFlos reference material；3.negative sample;4-6.Jinmeiqingshu Granules sample.

2.2綠原酸HPLC含量測(cè)定

2.2.1色譜條件 采用Inertsil ODS-3(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；以乙腈-4 mL·L-1磷酸溶液為流動(dòng)相，等度洗脫，洗脫體積比為8∶92；柱溫為35 ℃；流速為1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)為327 nm；進(jìn)樣量為5 μL。

2.2.2對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取綠原酸對(duì)照品適量，置于棕色量瓶中，加甲醇溶解，制成質(zhì)量濃度為0.283 0 mg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取上述對(duì)照品儲(chǔ)備液5～50 mL，置于棕色量瓶中，加甲醇稀釋定容并搖勻，制成質(zhì)量濃度為0.028 30 mg·mL-1的對(duì)照品溶液，備用。

2.2.3供試品溶液的制備 取樣品粉末0.25 g，精密稱(chēng)定，置于具塞錐形瓶中，精密加入體積分?jǐn)?shù)為30%的甲醇25 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理(功率300 W，頻率25 kHz)30 min后冷卻至室溫，再加甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，備用。

2.2.4陰性對(duì)照溶液的制備 取處方中的全部藥味，按照處方比例制成缺山銀花和烏梅2味藥材的陰性對(duì)照樣品，按照2.2.3項(xiàng)下制備方法制得陰性對(duì)照溶液。

2.2.5線(xiàn)性關(guān)系考察 分別精密吸取對(duì)照品溶液2，5，5，1和1 mL，分別置于5，50，100，25和50 mL的棕色量瓶中，加甲醇稀釋定容并搖勻，分別進(jìn)樣5 μL，測(cè)定，以進(jìn)樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)、綠原酸的峰面積為縱坐標(biāo)(y)，進(jìn)行線(xiàn)性回歸，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。其回歸方程為：y=107x-930.94，r=1.000。結(jié)果表明，綠原酸含量在28.3～566.0 μg范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。按照信噪比(S/N)的3和10倍考察檢測(cè)限(n=2)和定量限(n=6)，結(jié)果檢測(cè)限和定量限分別為4.245和11.320 ng。

2.2.6專(zhuān)屬性實(shí)驗(yàn) 取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液，按照2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，HPLC圖見(jiàn)圖2。結(jié)果顯示，陰性對(duì)照溶液的HPLC圖中，在綠原酸色譜峰保留時(shí)間附近無(wú)其他色譜峰干擾，表明該方法專(zhuān)屬性良好。

圖2HPLC圖

A.對(duì)照品；B.金梅清暑顆粒樣品；C.陰性樣品;1.綠原酸。

Fig.2 HPLC chromatograms

A.reference substance；B.Jinmeiqingshu Granules sample；C.negative sample;1.chlorogenic acid.

2.2.7精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取2.2.3項(xiàng)下制備的供試品溶液5 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算得供試品中綠原酸峰面積的RSD值為1.51%(n=6)，結(jié)果表明，該儀器精密度良好。

2.2.8穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一室溫下放置的供試品溶液，精密吸取5 μL，分別在0，2，4，6，8，12和24 h后進(jìn)樣，計(jì)算其RSD值。結(jié)果，綠原酸峰面積的RSD值為1.91%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.9重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批樣品(批號(hào)20160302)，按照2.2.3項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，測(cè)定，結(jié)果綠原酸峰面積的RSD值為1.80%(n=6)，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.10加樣回收實(shí)驗(yàn) 取樣品(批號(hào)20160302，綠原酸含量為 1.58 mg·g-1)0.125 g，共6份，精密稱(chēng)定，分別加入對(duì)照品溶液(含綠原酸0.198 1 mg)，按照2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定并計(jì)算，結(jié)果綠原酸的平均回收率為104.56%，RSD值為2.53%。見(jiàn)表1。

表1綠原酸加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.1 Results of recovery test of chlorogenic acid (n=6)

樣品取樣量/g樣品中綠原酸含量/mg添加綠原酸量/mg實(shí)測(cè)綠原酸量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%10.123 70.195 40.198 10.404 0105.30104.562.5320.122 80.194 00.198 10.401 4104.6930.122 10.192 90.198 10.400 0104.5440.116 20.183 60.198 10.399 6109.0450.127 00.200 70.198 10.402 2101.7260.124 80.197 20.198 10.399 4102.07

2.2.11耐用性實(shí)驗(yàn) 選擇2種不同品牌的色譜柱，對(duì)已建立的方法耐用程度進(jìn)行考察。結(jié)果顯示，不同條件下，綠原酸色譜峰的對(duì)稱(chēng)因子、分離度和理論塔板數(shù)均達(dá)到準(zhǔn)確定量要求，表明該方法耐用性良好。見(jiàn)表2。

表2耐用性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.2 Results of robustness test (n=2)

色譜柱不同批號(hào)的綠原酸含量/mg·g-1201603012016030220160303Inertsil ODS-3(250 mm×4.6 mm,5 μm)3.621.613.21Kromasil 100-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)3.661.672.98RSD/%0.551.833.72

2.2.12含量測(cè)定 按照2.2.3項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液2份，按照2.2.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，采用外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算金梅清暑顆粒中綠原酸的含量，結(jié)果10批金梅清暑顆粒樣品中綠原酸的含量分別為3.66，1.67，2.98，1.78，1.86，2.54，2.52，3.63，3.82和4.00 mg·g-1，平均值為2.85 mg·g-1?？紤]到綠原酸化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，受熱易分解[4-6]，且該制劑的整個(gè)工藝過(guò)程較為復(fù)雜，會(huì)導(dǎo)致綠原酸進(jìn)一步分解，故按照成品含量平均值的70%折算為1.995 mg·g-1。因此，暫擬定本品山銀花和烏梅以綠原酸(C16H18O9)計(jì)含量不得少于2.0 mg·g-1。

3 討論

3.1TLC專(zhuān)屬性考察 近年來(lái)，市場(chǎng)上金銀花和山銀花藥材混用的現(xiàn)象較為嚴(yán)重[7-8]，使用金銀花或山銀花藥材作為原料的中藥制劑更是難以辨別[9-10]。如不能將二者準(zhǔn)確區(qū)分開(kāi)，易對(duì)患者的用藥安全埋下隱患。筆者通過(guò)前期文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，二者雖然為同屬植物，但化學(xué)成分有較大區(qū)別[11-16]。其中，灰氈毛忍冬皂苷乙是山銀花的特征性成分[17-20]，而金銀花中不含有此成分，故可將灰氈毛忍冬皂苷乙是否檢出作為區(qū)分本制劑中為金銀花還是山銀花投料生產(chǎn)的有效鑒別手段。本實(shí)驗(yàn)建立的TLC鑒別方法特征斑點(diǎn)明顯，分離效果好，能夠作為該制劑中山銀花的專(zhuān)屬性鑒別。

3.2TLC溫度考察 TLC實(shí)驗(yàn)中使用了三氯甲烷-甲醇-水(6∶4∶1)為展開(kāi)劑，發(fā)現(xiàn)在室溫條件下重復(fù)性較差，樣品圖譜易拖尾，影響結(jié)果判定。而將樣品放置在10 ℃以下保存的展開(kāi)劑中展開(kāi)，則重復(fù)性良好，故采用其作為展開(kāi)條件。

3.3HPLC流動(dòng)相的選擇 HPLC實(shí)驗(yàn)中比較了3種不同的流動(dòng)相系統(tǒng)，分別是乙腈-4 mL·L-1磷酸、甲醇-4 mL·L-1磷酸和甲醇-水-冰醋酸。結(jié)果表明，在乙腈-4 mL·L-1磷酸流動(dòng)相系統(tǒng)下，綠原酸色譜峰的保留時(shí)間適宜，分離度良好。

3.4HPLC前處理?xiàng)l件優(yōu)化 在建立HPLC法測(cè)定山銀花和烏梅中綠原酸含量的方法中，筆者進(jìn)行了以下單因素系統(tǒng)考察實(shí)驗(yàn)：體積分?jǐn)?shù)為30%的甲醇、體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇、體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇、甲醇和乙醇共5種提取溶劑；超聲和回流2種提取方法；不同提取時(shí)間(30，45和60 min)。結(jié)果表明，在提取溶劑為體積分?jǐn)?shù)為30%的甲醇、超聲提取30 min的條件下，金梅清暑顆粒中的綠原酸提取率達(dá)到最佳。

本實(shí)驗(yàn)方法首次建立了投料藥材為山銀花的金梅清暑顆粒的定性定量質(zhì)量控制方法，結(jié)果快速、簡(jiǎn)便、靈敏度高，為金梅清暑顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)修訂的提升提供參考，同時(shí)也對(duì)其他含山銀花中藥制劑的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。