基于納米遞送系統的黑色素瘤免疫治療的研究進展

戴 爽，覃虹錕，王鑫怡，宗 莉*，王亞菁*

(1.中國藥科大學藥學院藥劑學教研室，南京 211198；2.中國藥科大學基礎醫學與臨床藥學學院生理學教研室，南京 211198；3.中國藥科大學藥學院藥物分析教研室，南京 211198)

黑色素瘤是一種惡性皮膚癌，其發病率占皮膚癌的5%，致死率卻高達皮膚癌相關死亡的75%[1]。早期黑色素瘤主要通過手術切除進行治療，但晚期和已轉移的黑色素瘤極難治療，死亡率極高，晚期黑色素瘤病人5年生存率低于20%[2]。轉移瘤的治療主要包括化學治療[3]、放射治療[4]、靶向治療[5]和免疫治療[6]。其中免疫治療近年來成為黑色素瘤治療的研究熱點之一，而與納米遞送系統聯用更是有望解決黑色素瘤免疫治療的現存問題。本文就基于納米遞送系統的黑色素瘤免疫治療研究現狀進行簡要綜述。

1 黑色素瘤免疫治療現狀

黑色素瘤是最具有免疫原性的腫瘤之一，易于逃脫免疫監控、易轉移復發。免疫治療已被應用于黑色素瘤的治療[7]，主要包括細胞因子治療[8]、免疫檢查點阻斷免疫治療[9]、過繼性免疫治療[10]和嵌合抗原受體T細胞免疫治療[11]等。

免疫檢查點抑制劑獲批之前，美國FDA批準采用化療(氮烯唑胺)、羥基脲或免疫治療(高劑量IL-2)作為晚期黑色素瘤的治療方案[1，12-13]。這些方案首次給藥有效率較高，能顯著提高總體生存率，但一般6～9個月后就會復發[14]。IL-2可延長緩解期，但其半衰期短，需要多次大劑量注射，具有嚴重的不良反應[15]。2011年，美國FDA批準了首個免疫檢查點抑制劑ipilimumab(CTLA-4抑制劑)，用于治療晚期黑色素瘤，此后免疫檢查點抑制劑成為公認的晚期黑色素瘤免疫治療有效策略，顯著推進了晚期黑色素瘤免疫治療的發展。但免疫檢查點抑制劑僅對很小一部分病人有效，大部分病人對此類抑制劑沒有免疫響應。

2 納米遞送系統的應用

納米遞送系統，即納米尺寸(1～100 nm)的藥物遞送系統，包括無機材料、有機材料和細胞仿生型等載體系統，具有降低給藥劑量、延長抗原呈現時間、增加穩定性和誘導產生更強烈的T細胞免疫反應等優點，有望用于晚期黑色素瘤的治療[16-18]。

2.1無機納米載體 無機納米載體主要是指無機材料(如金[19]、鐵[20]、石墨烯[21]和介孔硅[22]等)構建的納米載體，具有粒徑小、尺寸可調、比表面積大、易修飾、穩定性好和理化性質特殊等優點。

無機納米載體應用于黑色素瘤免疫治療，可增強誘導抗原特異性T細胞的增殖，促進效應T細胞發揮作用。納米技術為免疫治療提供了新的遞送策略，但要實現高效激活T細胞仍待進一步完善。Steenblock E R等[23]報道，納米粒誘導產生的短期免疫反應遠不如微粒。Perica K等[24]基于生物相容性氧化鐵納米粒(50～100 nm)或生物素包裹的量子點納米晶(約30 nm)2種納米制劑，構建了人造抗原呈遞細胞(APCs)納米遞送系統。體外實驗表明，構建的2種載體都能誘導小鼠脾臟細胞和人外周血T細胞產生抗原特異性T細胞增殖。選用接種黑色素瘤細胞B16的裸鼠進行體內實驗，能有效預刺激特異性細胞毒T淋巴細胞，減緩腫瘤生長，且效果優于對照的人造APCs微米遞送系統。

此外，無機納米粒因其獨特的光、電、磁性質，在顯影成像方面具有一定優勢。常用的細胞追蹤方法是通過報告基因標記細胞，該標記方法持續時間較長，存在組織透光性差、無法定量等問題[25]。Meir R等[26]人工改造T細胞使其可以表達黑色素瘤特異性T細胞受體，并標記上葡萄糖修飾的金納米粒(約20 nm)作為計算機斷層掃描(CT)造影劑，將該T細胞靜脈注射進入移植了人黑色素瘤的小鼠體內，可以追蹤檢測T細胞在體內的分布、遷移和動力學。金納米粒不影響人工T細胞在小鼠體內的分布和功能，且能穩定標記在T細胞上，用于T細胞的CT追蹤。Chen F等[22]采用Cy5熒光二氧化硅納米粒，與黑皮素受體1(MC1-R)靶向的α黑色素細胞刺激素(αMSH)肽結合，用于黑色素瘤特異性顯影。MC1-R是靶向黑色素瘤特異性標志物的一種多肽，但由于腎攝取過多影響了其在臨床效果和治療中的應用，該二氧化硅納米粒能有效解決這一問題。通過表面修飾優化的αMSH肽，納米粒與MC1-R的親和力能提高10倍。體內實驗表明，該二氧化硅納米粒在黑色素瘤小鼠模型中能有效靶向腫瘤，示蹤顯示其易通過受體介導的方式被腫瘤細胞內吞。該納米遞送系統較好地克服了現有臨床黑色素瘤抗體類探針的耐藥和脫靶毒性等缺點，有望用于黑色素瘤特異性顯影和治療。

2.2有機納米載體 有機納米載體一般指以天然或合成有機高分子材料制備的納米粒。天然高分子材料包括殼聚糖[27]、海藻酸鈉[28]、透明質酸[29]和當歸多糖[30]等，合成高分子材料包括聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)[31]、聚乙烯亞胺(PEI)[32]和聚酰胺-胺(PAMAM)樹狀大分子聚合物[33]等。有機高分子材料一般具有毒性低和生物可降解性等優點。有機納米遞送系統既能通過載體修飾提高遞送效率和抗原呈遞效率，又能保護免疫疫苗不被降解，高效低毒地將藥物遞送至特定部位。

有機納米載體能夠降低劑量，減小毒性，尤其是對于半衰期較短、劑量較大的藥物。IL-2具有抗腫瘤活性，但重組IL-2蛋白在血清中半衰期短，需要重復大劑量注射才能起到效果，因而具有嚴重的不良反應[34]。Yao H等[35]在低相對分子質量聚乙烯亞胺(600 Da)上連接β環糊精，再修飾上葉酸，將制備得到的高分子材料和IL-2質粒混合制備成約100 nm的復合物。癌旁注射該復合物能有效抑制腫瘤生長，延長B16-F1黑色素瘤移植C57BL/6小鼠的生存期。此外，該復合物能刺激外周血中CD8+，CD4+ T細胞和自然殺傷細胞的激活和增殖，并增加其向腫瘤環境中的滲透。Park J等[36]采用脂質聚合物凝膠遞送高劑量IL-2至免疫抑制的腫瘤微環境中，結果表明，該納米制劑能有效提高生存率和自然殺傷細胞活性，延緩黑色素瘤生長。

有機納米載體能夠將包裹的抗原遞送給APCs，保護抗原肽等不被酶解，提高穩定性。黑色素瘤免疫治療中常涉及抗原肽的遞送問題。有機高分子材料，如PLGA，形成的納米粒能有效保護抗原肽。有報道應用PLGA納米粒用于遞送小鼠黑色素瘤抗原多肽重組人gp100(hgp100)和酪氨酸酶相關蛋白2(TRP2)。當注射進黑色素瘤小鼠后，與多肽和弗氏佐劑的混合制劑相比，這些載多肽的PLGA納米粒被樹突狀細胞(DCs)攝取更多，且誘導產生抗原特異性T細胞反應更加強烈[17]。通過表面修飾DCs特異性或陽性的受體/生物標志物，可顯著提高納米粒遞送到DCs的效率，促進攝取和內化，增強抗原呈遞給T淋巴細胞的能力[16，37]。

此外，載抗原納米粒有助于抗原被DCs攝取，避免疫苗制劑導致的過度炎癥反應(如鋁鹽，弗氏佐劑)。另外，鑒于可溶性蛋白或多肽是通過胞飲被APCs攝取，體內極少呈現為膜上的主要組織相容性復合體(MHC)配體，聚合物納米粒包裹的抗原通過吞噬作用被內化，能更有效的通過MHCⅠ類途徑被交叉呈遞給CD8+細胞[38]。因此，聚合物納米粒介導的抗原遞送系統可以誘導產生強烈的T細胞免疫。

2.3細胞-納米仿生型載體 近期，細胞或細胞膜載體被用于藥物遞送，包括紅細胞[39]、巨噬細胞[40]、自然殺傷細胞[41]和干細胞[42]等。與外源性遞送系統相比，細胞載體屬于內源性載體，免疫原性低，且具有長循環、自主靶向等優點，在黑色素瘤免疫治療中有一定的優勢[43]。

免疫細胞等循環細胞近年來成為新型遞送載體，具有長循環等特點，有些免疫細胞還具有腫瘤趨向性。Xie Z等[44]選用人外周血的單核細胞(THP-1)，攝取包裹維羅非尼(Vemurafenib)的聚合物納米粒進入胞內，形成單核/巨噬細胞遞送系統，以靶向治療黑色素瘤。THP-1作為單核細胞模型，與腫瘤細胞和炎癥細胞之間的親和力高。利用THP-1作為免疫細胞靶向腫瘤細胞的能力，內吞可降解納米粒，通過細胞內載藥，實現腫瘤特異性藥物遞送。體外實驗結果表明，基于THP-1的納米粒遞送系統能有效發揮維羅非尼對1205Lu和WM35 2種黑色素瘤細胞的殺傷作用。這種遞送系統不僅有望用于其他免疫治療藥物的遞送，也有望用于其他涉及固有免疫反應的疾病。

抗原呈遞給APCs是啟動免疫應答的關鍵步驟，一些天然的微生物處于微米級尺寸，易被APCs識別，發揮疫苗佐劑的作用，如釀酒酵母S.cerevisiae可靶向遞送抗原至APCs，且無病原性，能起到免疫佐劑的作用[45]。Liu D Q等[46]采用重組釀酒酵母作為疫苗載體，該重組釀酒酵母的細胞壁上能表達黑色素瘤相關抗原Trp2，并通過靜電作用在酵母細胞壁上修飾包裹了吲哚2,3-雙加氧酶(IDO)siRNA的PEI納米粒，以克服免疫抑制。該細胞遞送系統遞送的特異性siRNA能被APCs有效攝取，產生強烈的抗腫瘤免疫反應和siRNA的用量和毒性。體內外實驗表明，該酵母細胞遞送載體能有效抑制DCs中的IDO表達，促進抗Trp2的T細胞免疫反應，降低了調節性T細胞的產生。此外，重組酒釀酵母遞送系統通過削弱免疫抑制，促進Trp2特異性CD8+ T細胞免疫應答，顯著抑制了小鼠黑色素瘤生長。

除了一些細胞載體外，也有一些是只基于細胞膜設計的遞送系統，具有生物組成、抗原成分和理化性質方面的優點。Guo Y等[47]采用紅細胞膜包裹PLGA納米粒，構建了一種新型抗原肽遞送系統。該系統兼具PLGA納米粒的載藥功能和紅細胞膜的固有性質。紅細胞可用于將抗原靶向遞送給DCs，誘導產生細胞毒性T淋巴細胞反應。作為抗原載體，紅細胞膜可以保護抗原不被血液清除，遞送抗原，APCs處理后直接將抗原遞送給免疫細胞[48]。將DSPE-PEG-甘露糖組裝到紅細胞膜上，構建了DSPE-PEG-甘露糖-紅細胞膜載體，再將載有hgp的 PLGA納米粒(雙硫鍵連接hgp和PLGA)包裹其中，形成的遞送系統能夠有效靶向淋巴組織中的APCs，體內外實驗表明，對黑色素瘤均具有較好的療效。

3 小結

作為最難治療的腫瘤之一，晚期黑色素瘤一直處于腫瘤免疫治療的前沿[49]。除了免疫檢查點抑制劑外，一些其他新型免疫治療方式也正在探索發展中[50]，包括溶瘤病毒療法[51]和治療疫苗[52]等。但目前的黑色素瘤免疫治療存在不良反應、響應低和復發高等問題[18，53-54]。

納米遞送系統有望解決黑色素瘤免疫治療現存的問題。無機納米遞送系統，不僅能增強治療效果，還能實現成像和追蹤。有機納米遞送系統，既能保護免疫多肽和核酸不被降解，又能實現藥物的緩釋控釋。細胞-納米仿生型遞送系統不僅能避免外源性遞送系統的高免疫原性，還能自主靶向，提高遞送效率，增強療效。

雖然將納米遞送系統應用于黑色素瘤免疫治療的研究取得了許多進展，但仍存在一些問題有待解決。如納米遞送系統所依賴的EPR效應存在一定的局限性，無法應用于腫瘤內低灌注和缺氧的部分[55]。納米遞送系統進入機體后，易被網狀內皮系統清除，限制了其在黑色素瘤免疫治療中的實際應用[56]，這些需要進一步的研究改善。

近年來基于納米遞送系統的黑色素瘤免疫治療有了許多進展，但還存在納米遞送的實際靶向效果遠低于理論設計、機體免疫應答的個體差異大和晚期黑色素瘤生存期短等問題。基于納米遞送系統的黑色素瘤免疫治療有待進一步研究和完善，以應用于臨床。